MiR-205在肾透明细胞癌中的表达及作用机制研究

【摘要】[研究背景]肾癌(renalcellcarcinoma,RCC)是常见的泌尿系恶性肿瘤,其发病率位居泌尿系肿瘤的第二位,仅次于膀胱癌,占全身恶性肿瘤的3%。肾癌的组织分型中以肾透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,ccRCC)最为多见,约占80-85%。目前对于早期肾癌,根治性肾切除的治疗效果确切,但对于已发生浸润转移的晚期肾癌患者或术后复发转移患者仍缺乏十分有效的治疗手段,其5年生存率均低于9%。既往的研究表明,RCC的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,其中涉及众多的癌基因、抑癌基因和生长因子的激活或异常表达。因此,阐明RCC发生发展的分子遗传机制并在此基础上探索新的早期诊断和治疗方法具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码调控的单链小RNA分子,长度约22个核苷酸。miRNAs介导的基因调控发生在转录后水平,通过与其靶mRNA分子的3’非翻译区(3’un-translatedregion,3’UTR)互补配对,使靶mRNA分子的翻译受到抑制或直接降解靶mRNA,从而对靶基因的表达起负性调控作用。研究发现,miRNAs不仅参与了个体的生长、发育、凋亡、分化等多种生理过程,在机体多种病理过程中也发挥着重要作用,包括肿瘤的发生和发展。最近多项研究证实,miRNAs在RCC的发生发展中具有重要作用,可通过直接靶向作用一些癌基因或抑癌基因而调控RCC细胞的生长、凋亡和侵袭转移等生物学行为。尽管miRNAs在RCC发生发展调控中的重要性业已吸引了国内外众多学者的关注,绝大多数miRNAs在RCC中的作用及其作用机制依然未知,迫切需要进一步研究。为了探索miR-205与肾透明细胞癌发生、发展的关系,我们在本研究首先利用实时定量PCR检测了肾透明细胞癌组织及癌旁非肿瘤组织中miR-205的表达情况,并研究其与肾癌临床分期、病理分级之间的关系。然后检测了miR-205在各肾癌细胞株及正常肾小管上皮细胞株中的表达情况,并以此筛选出合适的肾癌细胞株作为体外研究对象,研究miR-205对肾癌细胞生长、凋亡、侵袭迁移等生物学行为的影响。最后用生物信息学预测miR-205可能的靶基因,并用体外实验进行初步验证,探讨miR-205在肾透明细胞癌中可能的作用机制,为肾癌的诊断和治疗提供新的思路。[方法与结果]1.miR-205在肾透明细胞癌组织中的表达水平显著下调：采用实时定量PCR检测20例ccRCC组织及癌旁非肿瘤组织中miR-205的相对表达量,结果miR-205在ccRCC组织组织中的表达显著低于癌旁非肿瘤组织(3.60±1.92vs6.39±3.39,P<0.05)。2.miR-205的低表达与肾癌临床分期、病理分级无相关：根据病理分级和临床分期分别将20例ccRCC组织样本进行分组并比较各组之间miR-205的表达,结果发现高分化组(n=12)与中-低分化组(n=8)、Ⅰ期(n=13)与Ⅱ-Ⅲ期(n=7)之间miR-205的相对表达量均无显著差异(分别为3.66±2.24vs3.51±1.42和3.73±2.16vs3.36±1.48,P>0.05)。3.过表达miR-205抑制ACHN细胞的生长和侵袭转移、诱导凋亡：利用实时定量PCR检测肾癌细胞株Caki-1、ACHN及正常肾小管上皮细胞HK-2中mir-205的表达,结果显示,miR-205在Caki-1、ACHN细胞中的相对表达量均显著低于HK-2细胞(分别为1.32±0.13、1.06±0.13、3.95±0.37,P<0.05),且在ACHN细胞中的表达水平最低。选取ACHN作为研究对象,使用LipofectamineTM2000转染miR-205mimics于ACHN株,升高miR-205的表达。实验分组：空白对照组(B.C)、miR-205阴性对照组(N.C)、miR-205模拟物转染组(miR-205),实时定量PCR检测各组miR-205的表达水平,MTT法、AnnexinV&PI双染法、流式细胞术(FCM)、Transwell细胞侵袭实验和迁移实验分别观察各组ACHN细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭能力的变化,结果显示,miR-205组中miR-205的相对表达含量显著高于B.C组、N.C组(依次为3.95±1.15、1.35±0.51、1.37±0.41,P<0.05)；MTT结果显示与B.C组、N.C组相比,miR-205组ACHN细胞生长出现明显抑制(P<0.05)；凋亡实验结果显示miR-205组ACHN细胞的凋亡率明显高于B.C组、N.C组(依次为12.37±1.38%、3.53±0.61%、3.72±0.66%,P<0.05)；流式细胞周期分析显示与B.C组、N.C组相比,miR-205组处于亚G1期中的细胞数明显升高,而相应S期中细胞数目却出现明显减少(P<0.05);Transwell侵袭和迁移实验结果显示,miR-205组细胞侵袭和迁移能力较B.C组、N.C组明显下降(P<0.05)。4.miR-205可能直接靶向调控E2F1和ZEB2：利用miRbase、TargetScan、miRanda等生物信息学方法预测miR-205可能的靶基因E2F1、ZEB2,实时定量PCR和Westernblot分别检测ACHN、Caki-1、HK2细胞中E2F1和ZEB2的表达及过表达miR-205对ACHN细胞中E2F1和ZEB2表达的影响,结果显示,ACHN、Caki-1细胞中E2F1和ZEB2在mRNA和蛋白表达水平均显著高于HK2(P<0.05)。mfR-205组中ZEB2在mRNA和蛋白表达水平均显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),miR-205组中E2F1蛋白表达水平显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),但E2F1mRNA在三组中的表达无明显差异(P>0.05)5.miR-205可能通过E2F1调控AKT信号通路：利用Westernblot分别检测B.C组、N.C组、miR-205组中AKT、pAKT、BAD、pBAD蛋白的表达,结果显示,miR-205组中pAKT和pBAD蛋白表达含量显著低于B.C组、N.C组(P<0.05),而AKT和BAD蛋白表达含量在三组中无明显差异P>0.05)。6.miR-205可能通过ZEB2调控EMT:采用免疫组化法检测20例ccRCC及癌旁非肿瘤组织中E-cadherin和Vimentin的表达,实时定量PCR法和Westernblot法检测ACHN、Caki-1、HK2由E-cadherin、Vimentin的表达及过表达miR-205对ACHN细胞中E-cadherin、Vimentin表达的影响,结果显示,ccRCC组织中E-cadherin阳性率明显低于癌旁非肿瘤组织(35%vs75%,P＜0.05),ccRCC组织中Vimentin阳性率明显高于癌旁非肿瘤组织(80%vs25%,P<0.05)。ACHN.Caki-1细胞中E-cadherin在mRNA和蛋白表达水平均显著低于HK2(P<0.05),ACHN、Caki-1细胞中Vimentin在mRNA和蛋白表达水平均显著高于HK2(P<0.05)。miR-205组中E-cadherin在mRNA和蛋白表达水平均显著高于B.C组、N.C组(P<0.05),miR-205组中Vimentin在mRNA和蛋白表达水平均显著低于B.C组、N.C组(P<0.05)。[结论]1.在ccRCC组织中miR-205的表达显著下调,提示miR-205可能与ccRCC的发生发展密切相关。miR-205表达水平的检测可能有助于肾透明细胞癌的诊断。miR-205表达水平与ccRCC的临床分期及病理分级无显著相关。2.miR-205在人肾癌细胞株ACHN、Caki-1中的表达显著低于人正常肾小管上皮细胞株HK-2中的表达。has-miR-205mimics能有效转染人肾癌细胞株ACHN,并升高ACHN细胞中miR-205的表达。3.过表达miR-205能够有效抑制ACHN细胞的增殖及侵袭迁移能力,促进ACHN细胞的凋亡,提示miR-205在肾癌中发挥抑癌基因的作用,上调miR-205表达可能是一种治疗肾癌的有效手段。4.肾癌细胞ACHN中miR-205可能直接靶向调控E2F1和ZEB2的表达。过表达miR-205诱导ACHN细胞凋亡的机制可能是抑制E2F1介导的AKT信号通路的活性。5.肾透明细胞癌中可能存在EMT机制,过表达miR-205抑制ACHN细胞侵袭迁移的机制可能是抑制ZEB2介导的EMT的发生。
【作者】陈志；
【导师】陈湘；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】miR-205；肾透明细胞癌；细胞增殖；细胞凋亡；细胞侵袭；

【参考文献】
[1]魏曦.在线酒店行业的定价策略研究[D].广东财经大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[2]尚佳妮.延安时期党内民主思想与实践研究[D].首都师范大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[3]李建奇,罗安,汤赐,唐杰.一种新型负序基波电流检测方法及其应用[J].电力系统自动化,2008,15:71-74.
[4]闵正俊.现金流贴现模型在企业价值评估中的应用[D].杭州电子科技大学,资产评估,2014,硕士.
[5]赵霄龙,张仁瑜.国内外建材业发展循环经济概览[J].住宅产业.2006(02)
[6]孔令韶,李渤生,郭柯,马茂华.喀喇昆仑、昆仑山地区植物中一些元素的自然含量特征[J].植物生态学报,1995,01:13-22.
[7]李凌.民国时期第三次全国美展研究[D].西南大学,美术学,2014,硕士.
[8]D.B.泰勒,R.特鲁曼,张德政.支护设计及开采诱导应力对关键块体稳定性影响的概率统计关键块分析——实例研究(二)[J].国外金属矿山.1993(12)
[9]王喜文,姜芳婷,索全伶,方玉珠,路勇.不同碳源催化化学气相沉积制备自支撑C/Ni-Fiber复合电极材料的电容脱盐性能[J].物理化学学报,2011,11:2605-2612.
[10]许建忠,王祖林,郭旭静.基于决策信息的毫米波/红外复合制导信息融合[J].控制与决策,2012,01:120-123+128.
[11]尹琦.建设工程监理法律制度研究[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[12]吴丽华.加拿大服务贸易国际竞争力研究[D].广东外语外贸大学,国际商务,2013,硕士.
[13]胡岗.新世纪“三农”小说的主题研究[D].海南大学,文艺学,2014,硕士.
[14]马庆申.临沂市土地利用变化及其生态环境效应分析[D].南京大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[15]禹迎迎.天然复合植物提取物对低温肉制品微生物及理化品质的影响[D].南京农业大学,食品科学,2013,硕士.
[16]颜小虎.中文搜索引擎的发展现状与趋势研究[D].北京印刷学院,2005.
[17]吴洋.中国韩语学习者的连接语尾“-（？）”和“-（？）”习得过程研究[D].广东外语外贸大学,亚非语言文学,2013,硕士.
[18]孙宁,胡世杰.2005中国石油科技大飞奔(上)[J].中国石油石化.2006(07)
[19]李云飞.基于.NET技术的高校教职工评价系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2014,硕士.
[20]褚素杰,李春红,韩军.两端短路同轴腔调谐滤波器耦合系数分析[J].无线电工程,2015,03:58-61.
[21]刘立吉.济宁市南二环钢桁拱桥安装施工方案分析[D].山东大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[22]李滢.新疆寨布查尔锡伯自治县锡伯族民歌的研究[D].东北师范大学,音乐学,2012,硕士.
[23]丁挺立.沪深300ETF期现套利机会差异性及套期保值效果的比较研究[D].江西财经大学,数量经济学,2013,硕士.
[24]李玮琦.马克思拜物教批判理论及其现代意义[D].辽宁大学,马克思主义哲学,2012,硕士.
[25]熊伟.小班幼儿语言能力培养的个案研究[D].华中师范大学,学前教育,2013,硕士.
[26]郭晶英.Pioneer Women’s Pursuit of Self-fulfillment[D].浙江大学,英语语言文学,2004,硕士.
[27]耿磊.shMRE11对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性及生物学行为的影响[D].遵义医学院,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[28]黄莹.延安时期中国共产党干部政策研究[D].广西民族大学,中共党史,2013,硕士.
[29]尚莉莉.长期定位施肥与土地利用方式对红壤团聚体稳定性的影响[D].华中农业大学,土壤学,2014,硕士.
[30]王莹.农村饮水安全工程管材合理选择与经济管径研究[D].宁夏大学,水利工程（专业学位）,2014,硕士.
[31]娄圣金.基于距离和的离群数据挖掘算法及应用[D].太原科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[32]刘君华.电磁兼容现场测试中的干扰源辨识技术研究[D].西安电子科技大学,机械电子工程,2012,硕士.
[33]张璐.长春黄金设计院质量管理体系研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[34]郭小琴.民国时期国文课本中的鲁迅作品价值取向研究[D].宁波大学,课程与教学论,2013,硕士.
[35]李霁坤,张群.模糊综合评判在钢铁企业候选供方中的应用[J].冶金自动化,2005,04:36-39.
[36]陈光发.行政诱惑调查的证据效力问题研究[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[37]唐平.中国留学工作管理研究及其信息系统开发[D].重庆大学,2003.
[38]朱敬如.海洋物理化学多参数综合监测系统研究[D].杭州电子科技大学,机械电子工程,2014,硕士.
[39]包文泉.内蒙古地区山杏重要性状遗传变异评价及优株选择[D].内蒙古农业大学,林木遗传育种,2013,硕士.
[40]刘高军,朱嬿.基于数据挖掘技术的建筑企业信用评价[J].中国矿业大学学报,2005,04:494-499.
[41]张文言.本科研究性教学的现状、问题与对策[D].华中师范大学,教育学原理,2013,硕士.
[42]杜晓宇.社会保障基金监督主体资格认定研究[D].辽宁大学,社会保障,2012,硕士.
[43]王超.基于汽车风速的风能发电系统研究[D].北京交通大学,2014.
[44]钱俊青,宋大威,单昱东.微水相酸性蛋白酶催化蔗糖乙酸酯合成研究[J].浙江工业大学学报,2013,02:119-121.
[45]殷国梅.冰草在荒漠草原地区生态生物学特性动态研究[D].内蒙古农业大学,草业科学,2004,硕士.
[46]毛秀英.金融支持安徽省民营经济发展研究[D].安徽大学,金融学,2013,硕士.
[47]马令.城际铁路与城市轨道交通同站台换乘研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[48]颜重光.近距离非接触射频识别IC卡芯片[J].中国电子商情(RFID技术与应用).2008(01)
[49]王鑫磊.卫星光通信系统中反射式光学天线优化设计[D].哈尔滨工业大学,光学工程,2014,硕士.
[50]张海锋.大学生生活事件、大五人格与心理韧性的关系研究[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.