LSD1对胃癌发生发展的调控机制及小分子抑制剂干预研究

【摘要】表观遗传学是指在DNA序列不变的前提下基因表达或细胞表型的可遗传变化，主要包括DNA甲基化，组蛋白共价修饰，染色质重塑，基因沉默和RNA编辑。其中，组蛋白修饰涉及许多生理生物化学过程，可通过调控染色质结构而激活或抑制基因表达。LSD1（HistoneLysineSpecificDemethylase1,组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1）是2004年确认的第一个组蛋白去甲基化酶，可去除组蛋白H3K4、H3K9和非组蛋白底物赖氨酸的甲基而调控其生物学功能。LSD1在多种肿瘤中高表达，用LSD1抑制剂或RNAi降低LSD1活性或表达量可抑制肿瘤生长。因此，获得高效、低毒、高选择性LSD1抑制剂是目前抗肿瘤药物研究热点。LSD1作为MAO-A/B（MonoamineOxidaseA/B，单胺氧化酶A/B）同源蛋白，以FAD（FlavinAdenineDinucletide，黄素腺嘌呤二核苷酸）作为辅酶发挥其生物学功能。因此，许多通过与FAD相互作用而抑制MAO活性的化合物亦可抑制LSD1活性，如2-PCPA（Tranylcypromine，苯环丙胺）。2010年有报道利用Click反应合成含三氮唑的MAO-A抑制剂，因此我们推测含1,2,3-三氮唑小分子MAO-A抑制剂对LSD1亦具有一定抑制活性。与此同时，二硫代甲酸酯类化合物由于其广泛的抗菌和抗肿瘤活性亦吸引我们的注意力。因此，本课题利用Click反应和药物设计中拼合原理，将1,2,3-三氮唑和氨基二硫代甲酸酯两个活性片段拼合在一个分子之中，设计并合成了一类含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯类化合物，检测其对LSD1抑制活性，对其进行衍生化，获得高效、高选择性LSD1抑制剂，并深入研究其体外、体内对肿瘤细胞增殖的抑制作用，抗肿瘤转移和侵袭作用及作用机制。我们的研究结果和主要发现包括：1)LSD1抑制剂筛选平台的建立及LSD1抑制剂的设计与合成；我们首先利用分子生物学方法构建了LSD1原核表达载体，并利用基因工程原核表达、分离纯化出LSD1重组蛋白；同时为进行选择性筛选，我们亦分离纯化了LSD1的另一同源蛋白LSD2。由于LSD1、LSD2去甲基化过程中可生成一分子过氧化氢，本研究使用荧光探针AmplexRed定量检测LSD1、LSD2作用于组蛋白底物过程中生成过氧化氢，定量判断LSD1、LSD2活性及我们设计合成的小分子化合物对其活性抑制作用，建立筛选平台。同时开展了1,2,3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯类LSD1抑制剂研究。通过对设计、合成69个化合物活性筛选和生物活性评价以及构效关系分析，发现一类具有全新结构的LSD1抑制剂，其中活性最好的是化合物30，其对LSD1抑制活性IC50为2.11μM。因此，以下研究以化合物30为主要研究对象开展。2)LSD1抑制剂在重组蛋白水平对LSD1活性的调控作用及其选择性研究；我们通过体外酶活性筛选实验证实：LSD1抑制剂化合物30可特异性作用于LSD1，而对LSD2抑制活性较弱，对MAO-A/B无抑制活性。通过稀释法和透析法研究发现，化合物30可通过非共价键与LSD1呈可逆性结合并抑制LSD1活性。酶动力学实验揭示化合物30可能竞争性作用于LSD1辅酶FAD所在活性口袋，可能是通过将FAD挤出LSD1活性中心调节LSD1活性；另一方面，化合物30亦有可能作用于LSD1别构区，通过改变酶构象将辅酶FAD“挤出”LSD1从而调节酶活性。分子对接及分子动力学模拟实验进一步预测化合物30是LSD1辅酶FAD竞争性抑制剂，化合物30可通过与LSD1形成分子间氢键占据FAD所在空穴位置，进而抑制FAD与LSD1的结合和活性。3)LSD1抑制剂在细胞水平对LSD1抑制活性、抑制肿瘤细胞增殖作用及其整体动物水平生物活性评价；胃癌细胞MGC-803中，我们发现LSD1选择性抑制剂化合物30可上调底物H3K4me1、H3K4me2和H3K9me2表达量，并特异性抑制LSD1高表达胃癌细胞系MGC-803、HGC-27细胞增殖，而对LSD1低表达胃黏膜正常细胞系GES-1和胃癌细胞系SGC-7901增殖无明显抑制作用。同时，化合物30可诱导MGC-803细胞凋亡并将细胞周期阻滞于G2/M期。整体动物水平实验显示，化合物30可抑制人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤生长，并显示出较低毒副作用。4)LSD1抑制剂抑制胃癌细胞转移和侵袭作用及其作用机制研究；划痕实验及transwell实验证实，在低于最低诱导细胞凋亡浓度下，化合物30可抑制细胞转移和侵袭。免疫共沉淀实验显示，化合物30可通过抑制LSD1与snai1相互作用，激活E-Cadherin启动子，上调EMT标志蛋白E-Cadherin表达。化合物30同时可抑制间质细胞标志蛋白N-Cadherin表达，从而抑制肿瘤细胞转移和侵袭。进一步Elisa实验证实，LSD1抑制剂化合物30可抑制MGC-803中TGFβ1（TransformingGrowthFactorbeta1，转化生长因子β1）表达，因此，我们推测化合物30通过调节LSD1活性及抑制TGFβ1表达，抑制肿瘤细胞EMT（epithelial-mesenchymaltransition，上皮-间质细胞转变）过程，最终抑制肿瘤细胞的转移和侵袭。5)胃癌细胞MGC-803及胃黏膜上皮细胞GES-1中TGFβ1对LSD1调控及作用机制；TGFβ超家族是一类结构相似但功能不同的肽类物质，其中TGFβ1含量最高并在癌症发生与发展中发挥重要作用。在正常组织中TGFβ1扮演着抑癌基因作用，抑制肿瘤生长；而在肿瘤组织中，随着肿瘤的恶化，TGFβ1可促进肿瘤生长。本课题研究发现胃癌细胞MGC-803中，不同浓度TGFβ1可时间依赖性上调LSD1表达。分别应用ERK抑制剂tangeretin，NF-κB抑制剂bay11-7085，p300抑制剂C646与TGFβ1联用均可抑制TGFβ1诱导的LSD1过表达，提示TGF-β1对LSD1的表达调控依赖上述ERK，NF-κB及p300调控通路。由于p300能够作用于LSD1启动子，我们应用萤光双报告基因实验进一步证实ERK、NF-κB、p300在TGFβ1诱导LSD1表达上调过程中对LSD1启动子活性的调节作用，因此推测TGFβ1可能通过激活ERK使其磷酸化，进而激活NF-κB使其亚基p65入核并被磷酸化，从而招募转录因子p300作用于LSD1启动子区，激活LSD1启动子并时间依赖性上调LSD1表达。而对正常胃黏膜上皮细胞GES-1，TGFβ1可失活ERK，从而阻断NF-κB激活，抑制p65的磷酸化，对LSD1表达无影响。通过上述研究工作，本课题共合成69个含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯类化合物。并对其开展了LSD1活性筛选和评价，对化合物30开展了重点研究。化合物30可逆性抑制LSD1活性，选择性抑制LSD1高表达胃细胞系MGC-803和HGC-27增殖，并可通过抑制细胞EMT过程抑制肿瘤细胞转移和侵袭。进一步研究发现，胃癌细胞MGC-803中TGFβ1激活ERK，NF-κB信号通路，招募p300激活LSD1启动子，上调LSD1表达。而胃黏膜上皮细胞中，TGFβ1对LSD1表达无调节作用。本研究首次报道可同时抑制肿瘤细胞增殖及转移的选择性LSD1抑制剂。同时揭示了胃癌细胞MGC-803及正常胃黏膜上皮细胞GES-1中TGFβ1对LSD1调控作用机制，为以LSD1为靶点抗肿瘤药物的开发及揭示肿瘤恶性增殖的分子机制提供重要理论和实验依据。
【作者】郑一超；
【导师】刘宏民；
【作者基本信息】郑州大学，药物化学，2014，博士
【关键词】LSD1；抑制剂；肿瘤；转移；侵袭；TGFβ1；

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