TPX2在膀胱癌发生发展中的作用及其初步分子机制研究

【摘要】在世界范围内，膀胱癌在美国是第七位最常发生的肿瘤，每年大约有13,000人因此死亡，在中国居泌尿生殖系统肿瘤发生率的第一位。膀胱尿路上皮癌作为最常见的膀胱癌亚型占所有膀胱癌的90%以上。尽管膀胱尿路上皮癌发生发展期间其诊断策略和生物分子标记研究取得了很大的进展，但是多于30%的膀胱尿路上皮癌病人复发，并最终进展为浸润型。因而，寻找和鉴定新的诊断或治疗膀胱癌病人的分子标记具有十分重要的意义。研究显示，恶性肿瘤是一种以细胞增殖、分化以及凋亡异常为特征的疾病。其主要特点是细胞的无限增殖能力和细胞周期的异常调控，这些成为肿瘤发生发展的主要原因。近年来，科研人员对肿瘤的关注逐渐转移到细胞周期的调控上，尤其是中心体，并发现中心体在调控细胞周期分布的变化以及细胞周期相关蛋白的表达中发挥重要的作用。因此中心体相关蛋白是继细胞周期，信号转导和细胞凋亡之后又一个肿瘤研究的热点。此外，越来越多的研究显示，中心体有望成为恶性肿瘤治疗的新的分子靶点，从而为恶性肿瘤的分子靶向治疗开辟了新的途径。TPX2是目前发现的一个与中心体密切相关的蛋白，在肿瘤细胞染色体20q经常出现基因的扩增，其中常常伴有TPX2的扩增存在。此外，TPX2也是一个微管相关蛋白，主要是哺乳动物细胞在着丝粒处负责微管的组装和形成，这一过程是通过与非洲爪蟾驱动蛋白类似的蛋白2（Xenopuskinesin-likeprotein2，Xklp2）的羧基末端结构域的结合来介导的。TPX2是Ran-GFP的下游调控基因，在纺锤体的组装和形成中发挥重要作用。在有丝分裂早期，TPX2以依赖RanGTP的方式被释放，从而和AuroraA激酶相互作用，进而起始纺锤体的装配。TPX2的表达在细胞周期阶段被严密的调控，经常在G1向S期过渡的时期可见其表达，在细胞质分裂时表达消失。因而TPX2表达对于评估肿瘤细胞的增殖行为具有重要的价值。近几年来，许多肿瘤中呈现出TPX2的异常表达，如在非小细胞肺癌中染色体20q11.2的扩增驱动了TPX2的拷贝数显著增加，胰腺导管腺癌中高水平的TPX2mRNA和蛋白的表达以及多于50%的巨大细胞骨肿瘤病人中呈现TPX2的高表达，这些研究提示TPX2可能成为肿瘤诊断和治疗的新的分子靶点。然而，迄今为止，世界范围内均未见TPX2在膀胱癌发生发展中的作用的研究报道，因此为了初步阐明TPX2在膀胱癌发生发展中的作用，在本研究中，作者首先通过免疫组织化学，半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测膀胱癌组织和正常组织中TPX2mRNA和蛋白的表达，并通过半定量RT-PCR检测不同临床阶段和不同转移状态的膀胱癌组织中TPX2的表达，分析其表达与膀胱癌病人临床病理学参数之间的关系，并通过资料随访探讨其表达与膀胱癌病人预后之间的关系，初步探讨其在膀胱癌发生发展中的可能作用。进一步通过TPX2基因获得或缺失技术分别上调或下调膀胱癌细胞TPX2的表达，研究其表达变化对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制。最后采用裸鼠移植瘤模型研究TPX2表达上调或下调对膀胱癌裸鼠移植瘤生长的影响。该研究有望为以TPX2为靶点的膀胱癌的分子靶向治疗提供新的实验证据。第一部分TPX2在膀胱癌组织中的表达及其在膀胱癌病人预后中的价值方法（1）采用免疫组织化学方法检测71例膀胱癌组织和相应的71例正常膀胱组织中TPX2蛋白表达。（2）采用半定量RT-PCR分析了随机选择的21例膀胱癌组织和相对应的正常组织中TPX2mRNA的表达。（3）采用实时荧光定量PCR检测随机选择的8例膀胱癌组织和相对应的正常组织中TPX2mRNA的表达。（4）采用Kaplan–Meier存活曲线分析TPX2蛋白表达与膀胱癌病人预后之间的关系。（5）统计学处理：应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用X±S表示。免疫组织化学结果采用X2进行评估，半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR采用单因素方差分析（One-wayANOVA），TPX2表达和膀胱癌病人预后之间的关系采用Kaplan–Meier存活曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。结果（1）TPX2主要定位于膀胱癌细胞的细胞质中。免疫组化的结果显示，TPX2在膀胱癌中高表达，在正常组织中不表达或者低表达。71例膀胱癌组织中TPX2的阳性表达率83.10%（59/71）高于正常组织12.68%（9/71），两者比较差异具有显著性（P<0.05）。（2）膀胱癌组织中TPX2mRNA的相对表达水平为0.485±0.06，显著高于正常组织中TPX2mRNA的表达水平（0.051±0.006），差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）实时荧光定量PCR结果显示，每例膀胱癌组织中TPX2mRNA的相对表达水平均显著高于对应的正常膀胱组织中TPX2mRNA的表达水平，差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）TPX2蛋白表达与膀胱癌患者的性别和年龄无关（P>0.05），但与患者的临床分期、组织学分级和淋巴结转移密切相关（P<0.05）。最为显著的是，在19例具有转移的膀胱癌病人中，TPX2蛋白表达的阳性率为100%。（5）膀胱癌患者处于pT2-T4阶段的组织标本中TPX2mRNA的表达水平显著高于pTa-T1阶段的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）具有淋巴结转移的膀胱癌患者其TPX2mRNA的表达水平显著高于无转移的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）具有TPX2高表达的膀胱癌患者的存活时间显著低于TPX2低表达或无表达的膀胱癌患者，且差异具有统计学意义（P<0.05）。第二部分TPX2在膀胱癌细胞中的表达及其对膀胱癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的调控作用方法（1）采用实时荧光定量PCR和Westernblotting技术检测膀胱癌T24、J82、5637和RT4细胞中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平。（2）利用脂质体2000将pcDNA3.1空载体、pcDNA-TPX2真核表达载体、TPX2siRNA和对照siRNA转染膀胱癌T24细胞，采用800μg/ml的G418筛选稳定表达TPX2和pcDNA3.1的膀胱癌T24稳定细胞株。（3）采用实时荧光定量PCR和Westernblotting对转染前后的膀胱癌T24细胞株进行鉴定。（4）采用CCK-8增殖实验检测TPX2过表达或表达下调对膀胱癌T24细胞增殖的影响。（5）采用流式细胞术检测TPX2过表达或表达下调对膀胱癌T24细胞周期和凋亡的影响。（6）采用Westernblotting技术检测转染前后T24细胞中cyclinD1、cdk2和p21蛋白表达的变化。（7）采用caspase-3比色分析试剂盒分析转染前后T24细胞中caspase-3活性的变化。（8）统计学处理：应用SPSS17.0软件处理数据，统计学数据用均数±标准差(X±S)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析，以P=0.05为检验水准。结果（1）T24细胞中呈现最高TPX2mRNA和蛋白的表达水平，显著著高于J82，5637和RT4细胞，差异具有统计学意义（P<0.05），此外，RT4呈现出最低的TPX2mRNA和蛋白的水平，与其它细胞株相比，TPX2mRNA和蛋白的表达具有显著性差异（P<0.05）。（2）pcDNA-TPX2转染组中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1转染组，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1转染组中TPX2mRNA和蛋白的表达无差异（P>0.05）。（3）TPX2siRNA组中TPX2mRNA和蛋白的相对表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组中TPX2mRNA和蛋白的表达无差异（P>0.05）。（4）TPX2过表达的膀胱癌T24细胞的增殖速度明显快于未处理组和空载体pcDNA3.1组，差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组相比，膀胱癌T24细胞的增殖速度无差异（P>0.05）。此外，TPX2下调的膀胱癌T24细胞的增殖速度明显慢于未处理组和对照siRNA组，差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组相比，膀胱癌T24细胞的增殖能力无差异（P>0.05）。（5）pcDNA-TPX2组中T24细胞在G0/G1期的细胞数比率显著低于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中T24细胞在G0/G1期的细胞数比率无差异（P>0.05），而S期细胞数的比率在三组之间无差异（P>0.05），而G2/M期的细胞数比率显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，TPX2siRNA组中T24细胞在G0/G1期的细胞数的比率显著高于未处理组和对照siRNA组，而S期和G2/M期的细胞数的比率显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组在细胞周期的各个时相上细胞数的比率无差异（P>0.05）。（6）TPX2表达上调显著上调膀胱癌T24细胞中cyclinD1和cdk2蛋白的表达，而显著下调p21蛋白的表达，且具有统计学差异（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中上述蛋白的表达无差异（P>0.05）。进一步研究显示，TPX2表达下调显著降低膀胱癌T24细胞中cyclinD1和cdk2蛋白的表达，而显著增加p21蛋白的表达，且具有统计学差异（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组中上述蛋白的表达无差异（P>0.05）。（7）与未处理组和空载体pcDNA3.1组相比，pcDNA-TPX2组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著降低，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无统计学差异（P>0.05）。此外，与未处理组和对照siRNA组相比，TPX2siRNA组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均显著升高，且差异具有统计学意义（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组中膀胱癌T24细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均无统计学差异（P>0.05）。（8）TPX2表达上调显著降低膀胱癌T24细胞中caspase-3的活性，且具有统计学差异（P<0.05），而未处理组和空载体pcDNA3.1组中caspase-3的活性无差异（P>0.05）。进一步研究发现，TPX2表达下调显著提升膀胱癌T24细胞中caspase-3的活性，且具有统计学差异（P<0.05），而未处理组和对照siRNA组中caspase-3的活性无差异（P>0.05）。第三部分TPX2表达变化在膀胱癌裸鼠移植瘤生长中的作用方法（1）实验分组：TPX2过表达分组：未处理组：接种未经任何处理的膀胱癌T24细胞；空载体转染组：接种稳定表达空载体pcDNA3.1的膀胱癌T24细胞；pcDNA-TPX2组：接种过表达TPX2的膀胱癌T24细胞。TPX2表达下调分组：未处理组：不进行任何治疗；对照siRNA组：肿瘤内注射对照siRNA进行治疗；TPX2siRNA组：肿瘤内注射TPX2siRNA进行治疗。（2）对于TPX2过表达实验，接肿膀胱癌T24细胞后，当瘤体达到80mm3左右时，每隔3天记录肿瘤的体积，当记录全部结束后，绘制肿瘤生长曲线，并剥离肿块，称量瘤体重量，比较不同组别的肿瘤重量。对于TPX2表达下调的实验，待肿瘤长到55-80mm3时，每3天注射一次对照siRNA和TPX2siRNA（100ng/μl），并每隔3天记录肿瘤的体积，当记录全部结束后，绘制肿瘤生长曲线，并剥离肿块，称量瘤体重量，比较不同组别的肿瘤重量。（3）采用实时荧光定量PCR检测不同组别的膀胱癌T24细胞的裸鼠移植瘤中TPX2mRNA的表达水平。（4）采用Westernblotting检测不同组别的膀胱癌T24细胞的裸鼠移植瘤中TPX2蛋白的表达水平。（5）统计学处理：所有的实验数据采用统计学软件SPSS17.0进行处理，数据采用x±s表示，多个样本的均数采用单因素方差分析。P<0.05，表示具有统计学差异。结果（1）TPX2过表达的T24细胞的裸鼠肿瘤组织中的TPX2mRNA和蛋白表达水平显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）TPX2siRNA治疗后的膀胱癌裸鼠肿瘤组织中的TPX2mRNA和蛋白表达水平显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）TPX2过表达组中裸鼠肿瘤的重量显著高于未处理组和空载体pcDNA3.1组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）TPX2表达下调组中裸鼠肿瘤的重量显著低于未处理组和对照siRNA组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）TPX2表达上调显著加速裸鼠肿瘤的生长，而TPX2表达下调显著抑制裸鼠肿瘤的生长。结论（1）TPX2的高表达与膀胱癌的发生发展密切相关。（2）TPX2可能成为膀胱癌转移和预后的分子标记。（3）TPX2的过表达加速膀胱癌T24细胞的增殖、缩短G0/G1期的细胞数的比率和抑制细胞凋亡。而TPX2表达下调抑制膀胱癌T24细胞的增殖、增加G0/G1期的细胞数的比率和诱导细胞凋亡。（4）TPX2介导的细胞周期和凋亡变化与cyclinD1、cdk2、p21和caspase-3的表达或活性变化密切相关。（5）TPX2过表达显著促进裸鼠肿瘤的生长，并显著增加其重量，而TPX2表达下调显著抑制裸鼠肿瘤的生长，并且显著降低其重量。
【作者】闫亮；
【导师】乔保平；
【作者基本信息】郑州大学，外科学，2014，博士
【关键词】TPX2；膀胱癌；转移；预后；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡；裸鼠；

【参考文献】
[1]郑理.「城中村」における流動人口[D].内蒙古大学,日语语言文学,2014,硕士.
[2]巨星.微型四旋翼飞行器实验平台的设计[D].河北大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[3]杜万雅.基于ESB的SOA框架的设计与实现[D].北京交通大学,2008.
[4]钟晓英.我国23个不同地区土壤磷素潜在淋失临界值的研究[D].中国农业大学,土壤与水,2004,硕士.
[5]吴宏太.羽博移动电源在乌兰巴托市的整合营销策略研究[D].哈尔滨工业大学,企业管理,2014,硕士.
[6]孙珑.论我国刑事禁止令的适用与完善[D].山东大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[7]陈云钦.动态环境下企业家心理韧性对战略变革的影响研究[D].南京理工大学,企业管理,2013,硕士.
[8]高洁.1644-1949年安徽中药材地理初探[D].安徽大学,历史地理学,2014,硕士.
[9]张硕.薛村矿3~#煤作保护层开采研究[D].河北工程大学,地质工程,2012,硕士.
[10]张亚茹.HeLa细胞中miR-106a、miR-376a和miR-485-5p对靶基因CDH1调控实验研究[D].华中师范大学,理论物理,2014,硕士.
[11]欧阳密,余振伟,张玉建,项文勤,胡彬,张诚.芴2,7位取代的9,9′-二芳基螺芴类化合物的合成及性能[J].有机化学,2012,03:552-559.
[12]袁善来.广西社会、历史、文化因素对语言文字使用状况影响初探[D].广西大学,汉语言文字学,2004,硕士.
[13]王志荣,陈玲霞,孙龙.”三软”矿区采掘工作面煤与瓦斯延期突出机理[J].中国矿业大学学报,2014,01:1.
[14]赵晓雨.社会分层对高等教育机会的影响[D].华中科技大学,高等教育学,2013,硕士.
[15]蔡自兴,谷明琴.城市环境中交通信号灯准确识别与状态估计[J].控制与决策,2014,01:163-167.
[16]白亮.基于现场总线的注塑机分布式控制器的设计与实现[D].杭州电子科技大学,计算机系统结构,2014,硕士.
[17]岳中屹.富集结肠癌肿瘤干细胞的球细胞与上皮间质转化之间关系的实验研究[D].华中科技大学,外科学,2013,硕士.
[18]翟宗仁,郑立刚.铜基钎料高温钎焊不锈钢晶间贯穿机理的研究[J].焊接学报.1988(01)
[19]谭琴.全谷豆复合包膳食纤维的分析及其对大鼠脂代谢紊乱及SREBP-1c调控的影响[D].扬州大学,营养与食品卫生学,2012,硕士.
[20]孙芳.免疫性血小板减少症患者血小板计数对ADAMTS13和VWF活性的影响[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[21]朱琳玲.基于扩展概念格的多数据库知识提取研究[D].合肥工业大学,2003.
[22]宋维琪,周红,刘泰生.用最大熵预测方法提取电磁场有效反射信号[J].石油地球物理勘探,1998,02:238-243+284.
[23]张弛.高压直流断路器及其关键技术[D].浙江大学,2014.
[24]李爱红,胡平,林宣雄.数据仓库在水环境质量评价系统中的应用前景[J].环境科学与技术,2004,03:52-54+117.
[25]甘睿.抗日战争时期中国共产党思想政治教育问题研究[D].西北师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[26]何江梅.盐酸沃尼妙林制剂的制备及抗菌效果研究[D].西南大学,微生物与生化药学,2014,硕士.
[27]张逊.西安市城中村改造后村民收入保障及增长模式研究[D].西安建筑科技大学,工程经济与管理,2013,硕士.
[28]王大众.大庆电信终端社会化项目风险管理研究[D].东北石油大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]冯文龙.ZY有限公司粉煤灰轻质保温建材项目投资效益分析[D].吉林大学,技术经济与管理,2013,硕士.
[30]薛缘.流动性过剩的定义、监测及货币政策选择[D].复旦大学,金融学,2012,硕士.
[31]秦彦博.密炼机温度控制的研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[32]伊鹏飞.显性和隐性教学结合方式在非英语专业词汇教学中的应用[D].吉林大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[33]马剑波.石墨烯聚电解质修饰及组装[D].曲阜师范大学,分析化学,2013,硕士.
[34]陈焕鑫.双卟啉笼状及三卟啉环状化合物的模板导向合成[D].杭州师范大学,有机化学,2013,硕士.
[35]蒋天飞.意大利文艺复兴美术理论中的“模仿论”[D].南京师范大学,美术学,2012,硕士.
[36]曹敏浩.模具框线位置视觉检测系统研究[D].湖北工业大学,测试计量技术与仪器,2013,硕士.
[37]孙邈.探讨TRPV1在炎症中的作用机制及EVO的干预作用[D].河南中医学院,中医内科学,2013,硕士.
[38]刘卓然.解放大街人防工程基坑开挖对邻近建筑物影响的研究[D].辽宁工程技术大学,桥梁与隧道工程,2012,硕士.
[39]马晔.在线实践社区中的教师实践性知识获取策略研究[D].首都师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[40]高建慧.低碳审计评价体系构建理论分析与实证研究[D].宁波大学,企业管理,2013,硕士.
[41]刘蕊.基于双边协调企业集团治理绩效研究[D].天津财经大学,工商管理,2012,硕士.
[42]张文江.河北省第十七届大学生运动会对邢台学院竞技体育发展的影响研究[D].河北师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[43]罗永江.多孔介质中孔隙冰制备方法的试验研究[D].吉林大学,地质工程,2013,硕士.
[44]赵江河,陈新,林涛,王鹏.基于智能电网的配电自动化建设[J].电力系统自动化,2012,18:33-36.
[45]石月萍.益心胶囊对实验性大鼠慢性心肌缺血模型血浆及心肌组织内皮素含量的影响[D].黑龙江中医药大学,中医内科学,2004,硕士.
[46]张文俊.网络群体性事件的形成机理及政府应对机制研究[D].江西财经大学,行政管理,2013,硕士.
[47]王永尧.热挤压不锈钢管酸洗液中硝酸的测定[J].四川冶金.1990(04)
[48]王小波.无刷直流电机自适应模糊PID算法研究[D].长安大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[49]刘冠杰.云计算技术在电信运营支撑集中化系统中的应用研究[D].南京邮电大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[50]孙震宇.吉林省建设银行电子银行营销策略研究[D].吉林大学,高级管理人员工商管理,2012,硕士.