DRG MZF1在神经病理性疼痛中的作用

【摘要】研究背景背根神经节（DRG）在神经病理性疼痛的发病机制中起着重要作用。许多研究证明背根神经节的电压门控钾离子通道（Kv）是决定神经元放电频率和和峰电位持续时间的关键因素，Kv1.2属于Kv1通透型亚型，参与形成Kvα四聚体，在背根神经节中大量表达。周围神经损伤诱导的神经病理性疼痛模型（如CCI模型）中，DRG神经元Kv1.2mRNA及蛋白表达下调，电流下降，兴奋性增强。最近研究发现，Kv1.2ASRNA（Kv1.2基因的长链非编码RNA）可负性调控Kv1.2基因（Kcna2）的表达，其基因启动子区含有髓样锌指蛋白1(MZF1)特异性的结合基序(161AGTGGGGA154)。SNL模型中，MZF1表达升高，与Kv1.2ASRNA基因启动子特异性基序（161AGTGGGGA154）的结合活性增强，结合量增多，更为重要的是，MZF1mRNA和Kv1.2ASRNA共同表达于DRG神经元。体外HEK-293T细胞和DRG细胞MZF1过表达或沉默时，Kv1.2ASRNA表达增高或降低，Kv1.2mRNA及蛋白表达下降或上调，这和脊神经结扎(SNL)或坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)模型中MZF1、Kcna2antisenseRNA、Kcna2mRNA表达情况类似，上述说明MZF1可能对Kcna2antisenseRNA基因的表达起着重要的调控作用，是病理性疼痛的潜在调节靶点。鉴于体内环境的复杂性，体外实验毕竟不能完全模拟体内过程,体内DRGMZF1与神经病理性疼痛的关系，目前尚不清楚。研究目的本研究通过大鼠在体DRG显微注射（Microinjection），上调或沉默DRGMZF1基因表达，观察大鼠疼痛行为学变化,检测MZF1、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA及蛋白表达变化，研究MZF1对DRG神经元电流和兴奋性的影响，确认体内DRGMZF1-Kv1.2ASRNA-Kv1.2mRNA通路和外周神经损伤诱导的神经病理性疼痛的关系，初步探讨针对DRGMZF1基因靶点进行干预治疗的可行性。研究方法1.雄性SD大鼠随机分为实验组（MZF1过表达组）和对照组（EGFP组），实验组DRG注射rAAV5-MZF14×1012GC/μl，对照组DRG注射rAAV5-EGFP4×1012GC/μl；于DRG注射前1天和DRG注射后1、3、4、6、8周完成后肢左右足机械性缩足反射阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷缩足潜伏期（CWL）测定后，取双侧L4-5DRG,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定大鼠L4-5DRGMZF1mRNA、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA表达，用Western-blot检测大鼠L4-5DRGMZF1、Kv1.2蛋白表达。2.雄性SD大鼠随机分为实验组（MZF1过表达组）和对照组（EGFP组），实验组rAAV5-MZF1和AAV5-EGFP混合液2μl（4×1012GC/μl,1:1混合）DRG注射，对照组AAV5-EGFP2μl（4×1012,GC/μl）DRG注射,5周后急性分离L4-5DRG神经元，全细胞膜片钳记录MZF1过表达对DRG神经元兴奋性的影响。3.雄性SD大鼠随机分为4组:PBS+CCI组（空白对照组）：PBS2μlDRG注射7天后，制备大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤模型(CCI)；MZF1siRNA+Sham组：MZF1siRNA（10μmol/L）2μlDRG注射7d后，仅暴露坐骨神经但不结扎；MZF1siRNA+CCI组：MZF1siRNA（10μmol/L）2μlDRG注射7d后，制备CCI模型；MZF1scramble+CCI组（错义序列组siRNA）：MZF1scramble（10μmol/L）2μlDRG注射7d后，制备CCI模型；四组大鼠分别于DRG注射前、CCI手术前CCI术后3、5、7天分别测定后肢左右两足MWT、TWL和CWL。行为学测试完成后，取双侧L4-5DRG,用RT-PCR检测大鼠L4-5DRGMZF1mRNA、Kv1.2ASRNA、Kv1.2mRNA表达，用Western-blot检测大鼠L4-5DRGMZF1、Kv1.2蛋白表达。4.雄性SD大鼠随机分为4组:CCI+PBS组：制备CCI模型7天后，行PBS2μlDRG注射；CCI+EGFP组：制备CCI模型7d后，行AAV5-EGFP（4×1012）2μlDRG注射；CCI+MZF1siRNA组：制备CCI模型7d后，行MZF1siRNA（10μmol/L）2μlDRG注射；CCI+MZF1scramble组：制备CCI模型7d后，行MZF1scramble（10μmol/L）2μlDRG注射；四组大鼠分别于CCI制备前1d、术后7d（DRG注射前），术后14d，17d分别测定左右后肢MWT、TWL和CWL。研究结果1.单侧L4-5DRG注射rAAV5-MZF1后，同侧大鼠后足机械性缩足反射阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)和冷缩足潜伏期（CWL）出现时间依赖性降低，4周后显著性降低，至少持续DRG注射后8周，同侧MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2ASRNA表达显著升高，Kv1.2mRNA和蛋白的表达显著降低，对侧未出现行为学和上述分子的变化。2.DRGMZF1的过表达显著增加细胞膜静息电位，降低动作电位发放的注入电流的阈值，增加大、中型DRG神经元的动作电位数。3.CCI增加同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和Kv1.2ASRNA的表达，减少Kv1.2mRNA和蛋白的表达，DRG注射MZF1siRNA后，显著阻断CCI诱导的同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2ASRNA增高，翻转CCI诱导的同侧L4-5DRG神经元Kv1.2mRNA和蛋白表达下调，减轻CCI术后3、5、7天(thedevelopment)的机械性痛觉过敏，热痛觉过敏，冷痛觉过敏。MZF1siRNADRG注射显著减少同侧L4-5DRG神经元MZF1mRNA和蛋白、Kv1.2ASRNA的表达，增加同侧L4-5DRG神经元Kv1.2mRNA和蛋白的表达，但MZF1siRNA错义序列DRG注射，并未影响CCI引起的同侧L4-5DRG神经元MZF1、Kv1.2ASRNA和Kv1.2表达变化，也未减轻CCI诱发的机械、热、冷痛敏反应。4.MZF1siRNADRG注射后显著减少CCI诱导的神经病理性疼痛维持期的机械、热和冷痛觉过敏。研究结论DRGMZF1通过Kv1.2ASRNA负性调控Kv1.2蛋白的表达，参与神经病理性疼痛的发展和维持过程，DRGMZF1可能是神经病理性疼痛预防和治疗的潜在靶点。
【作者】李治松；
【导师】张卫；
【作者基本信息】郑州大学，麻醉学（专业学位），2014，博士
【关键词】神经病理性疼痛；背根神经节（DRG）；DRG微注射；电压门控钾离子通道（Kv）；Kv1.2反义；RNA；髓样锌指蛋白1（MZF1）；RNA干扰；基因；

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