miR-27a通过靶向KRAS抑制食管鳞状细胞癌增殖和侵袭

【摘要】食管癌(EC)是临床上常见的一类消化系统恶性肿瘤。高通量检测发现多种微小RNA(miRNA)在正常组织与肿瘤组织中的表达水平具有明显的差异，参与了食管癌的发生发展进程。miR-27与多种肿瘤的发生密切相关，但尚无miR-27在食管鳞状细胞癌(ESCC)发生发展中作用的报道。本研究首先检测miR-27a与食管鳞状细胞癌的相关性，然后预测并验证miR-27a可通过其靶基因KRAS基因调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，表明miR-27a表达降低促进食管鳞状细胞癌的增殖和转移，为食管鳞状细胞癌提供了新的可能的治疗靶点。第一部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义研究方法1.在基因表达数据库(GEO)中检索食管鳞状细胞癌的miRNA芯片数据并进行分析。对44例食管鳞状细胞癌和32例食管腺癌中癌组织和癌周正常组织中miR-27a和miR-27b的表达量进行分析。2.采用RT-PCR检测25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织及其配对癌周正常组织中miR-27a的表达。3.采用RT-PCR检测6种食管鳞状细胞癌细胞系及正常食管上皮细胞中miR-27a的表达。结果1.检索GEO数据库，发现在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌病例中，miR-27a的表达显著下调(n=20,p=0.041)，而miR-27b改变不明显(n=24,p=0.785)。在32例食管腺癌中，无论有无淋巴结转移，miR-27a或miR-27b表达较癌周正常组织均无显著差异。2.在确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移患者的癌组织中miR-27a的表达显著低于癌周正常组织。3.6种食管鳞状细胞癌细胞系中miR-27a表达较正常食管上皮细胞均显著降低，其中TE-1细胞中miR-27a表达最低。结论miR-27a在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中表达降低，且在6种食管鳞状细胞癌细胞系中均表达降低，表明miR-27a可能参与食管鳞状细胞癌的发生和转移过程。第二部分：miR-27a在食管鳞状细胞癌组织、细胞中靶基因的研究研究方法1.采用TargetScan靶基因预测软件，预测miR-27a可能靶向KRAS基因。2.构建KRAS基因3’-UTR片段双荧光素酶报告载体(野生型和突变型)，分别与miR-27a或Scramble质粒共转染HEK293细胞，检测荧光值。3.在TE-1细胞中转染miR-27a前体、miR-27a抑制剂及其各自对照，分别采用RT-PCR和Westernblot检测KRASmRNA和KRAS蛋白的表达变化。4.通过RT-PCR对25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移的患者癌组织进行miR-27a检测，并通过westernblot检测KRAS蛋白的表达。结果1.KRAS基因3’-UTR有两个序列片段可能与miR-27a结合，分别是343-349和4583-4589位点。2.双荧光素酶实验证明：在转染野生型片段的细胞中，miR-27a高表达显著抑制荧光素表达；当将结合位点突变后，上述抑制作用丧失。3.miR-27a高表达抑制KRAS基因mRNA和蛋白表达，而抑制miR-27a可促进KRAS基因mRNA和KRAS蛋白表达。4.25例确诊食管鳞状细胞癌并伴有淋巴结转移的患者癌组织中miR-27a与KRAS基因mRNA和KRAS蛋白水平均呈负相关。结论miR-27a可靶向抑制食管鳞状细胞癌细胞KRAS基因的表达，并在伴有淋巴结转移的食管鳞状细胞癌组织中miR-27a与KRAS基因mRNA和蛋白表达均呈负相关，miR-27a的低表达与KRAS激活相关。第三部分：TE-1细胞中miR-27a靶向KRAS基因的作用机制研究方法1.在TE-1细胞中单独或共转染miR-27a和KRAS，RT-PCR和Westernblot检测miR-27a、KRAS、磷酸化ERK及c-Fos表达。2.在TE-1细胞中单独或共转染miR-27a和KRAS，MTT法检测细胞增殖。3.在TE-1细胞中转染miR-27a及其抑制剂，划痕实验检测细胞侵袭能力的改变。4.稳转miR-27a和miR-27a抑制剂的TE-1细胞，进行裸鼠成瘤实验，分别在10天、15天、20天、25天测量肿瘤体积，30天后分离瘤体测体积并称瘤重。结果1.在TE-1细胞中高表达miR-27a可抑制ERK磷酸化及其下游c-Fos的表达；抑制miR-27a可促进ERK磷酸化及其下游c-Fos的表达。共转染miR-27a和KRAS，外源性KRAS的表达减弱miR-27a对ERK的磷酸化。2.高表达miR-27a可抑制TE-1细胞增殖，抑制miR-27a可促进TE-1细胞增殖。而高表达KRAS，可逆转此现象。3.高表达miR-27a导致TE-1细胞对划痕修复能力减弱，而抑制miR-27a可使划痕修复增强。而共转染KRAS，可逆转miR-27a高表达对细胞迁移的抑制。4.裸鼠成瘤实验显示miR-27a高表达显著抑制肿瘤生长，而抑制miR-27a可显著促进肿瘤生长。结论miR-27a作为潜在的抑癌基因，可通过其靶基因KRAS调控下游Ras/Raf/MEK/ERK信号通路，抑制肿瘤的增殖和侵袭；食管鳞状细胞癌细胞中miR-27a表达降低可能是肿瘤发生和转移的机制之一。
【作者】朱利楠；
【导师】孙燕；樊青霞；
【作者基本信息】郑州大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】miRNA；食管鳞状细胞癌；KRAS；TE-1细胞；ERK通路；增殖；侵袭；

【参考文献】
[1]秦旭东.PDD-ICG试验在评价肝外科病人肝储备功能中的应用[D].山东大学,临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[2]王丹姝.中西休闲消费价值观比较研究[D].东北师范大学,新闻学,2012,硕士.
[3]李亚明.基于正交匹配追踪算法的新生儿疼痛表情识别[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[4]赵洪东.氧化态和掺杂聚苯胺的电沉积及防腐性能研究[D].大连理工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[5]王永存.石墨烯场效应晶体管设计加工及特性研究[D].中北大学,微纳技术及仪器,2014,硕士.
[6]谭锋.张拉薄膜结构的褶皱和动力分析[D].北京交通大学,2007.
[7]张云,胡劲松,魏子栋,万立骏.基于碳纳米管和石墨烯的非贵金属氧还原催化剂[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第23分会：电催化与洁净能源电化学转化[C].中国化学会:,2014:1.
[8]李涛.硅粉及纤维改性再生混凝土柱抗震性能试验研究[D].西安建筑科技大学,现代结构理论,2013,硕士.
[9]潘冬.高速铁路营运策略相关问题研究[D].西南交通大学,交通运输工程,2013,硕士.
[10]刘通.G银行信用卡电话服务中心客户满意度提升研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.
[11]李余文.劳务派遣法律适用问题研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[12]皮志刚.东亚区域货币合作及其机制研究[D].湘潭大学,区域经济学,2003,硕士.
[13]韩江.数据挖掘——极具发展潜力的新领域[J].苏州市职业大学学报,2004,01:56-58.
[14]卢丰.金融信贷与经济增长[D].山东大学,项目管理（专业学位）,2012,硕士.
[15]黄映,李扬,翁蓓蓓,马淑萍.考虑电网脆弱性的多目标电网规划[J].电力系统自动化,2010,23:36-41.
[16]杨春城.基于像素复用技术的硅基OLED微显示像素驱动电路研究[D].吉林大学,微电子学与固体电子学,2014,硕士.
[17]杜国庆,高晓黎,闾国年,张书亮.沿江港口码头管理系统中的空间知识挖掘[J].计算机工程与设计,2005,11:297-299.
[18]龙娟娟.湘江流域水权交易的法律思考[D].湖南师范大学,环境与资源保护法学,2013,硕士.
[19]崔凯.数字化城市管理模式的研究与设计[D].东北石油大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[20]王彩琴,杜玉扣.基于石墨烯和Au纳米粒子修饰的玻碳电极对抗坏血酸、多巴胺以及尿酸的同时检测[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第23分会：电催化与洁净能源电化学转化[C].中国化学会:,2014:1.
[21]刘佳.汉语重动句教学研究[D].吉林大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[22]袁广亮.电力系统远动主站端软件远程维护技术的应用研究[D].华北电力大学（河北）,计算机应用技术,2004,硕士.
[23]李俊领,解学军.离散时间直接型模型参考自适应控制(英文)[J].自动化学报,2007,10:1048-1052.
[24]陆宪忠.UFK-212型核辐射料位控制鉴定会在沪召开[J].冶金自动化,1980,02:60-61.
[25]金明亮,尹项根,胡婷,邵德军,游大海.采用加强制动的新型发电机差动保护[J].电力系统自动化,2009,11:62-66.
[26]徐晶晶.林可霉素生物合成抗性基因的功能研究[D].安徽大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[27]南洋,宁永权,马兰,姚泽坤,郭鸿镇.FGH4096/GH4133B双合金高温变形的动态软化行为[J].热加工工艺,2015,04:1-4.
[28]刘松莹.钴铟氧化石墨纳米复合材料的制备与其性能研究[D].黑龙江大学,2014.
[29]王兵树,管志敏,林永君,魏文超.基于自抗扰控制的火电厂主汽温控制系统及其参数整定[J].电力系统自动化,2008,21:82-86.
[30]范伟强.基于EVA模型对GL公司的价值评估[D].华南理工大学,高级管理人员工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[31]高尚.度假酒店地域性设计[D].华中科技大学,建筑学,2013,硕士.
[32]刘大军.广播电台综合业务网的功能与实现[J].广播与电视技术.2002(10)
[33]国九英,周兴元,李少英.二阶差分最大叠加能量法地表一致性静校正[J].石油地球物理勘探,1992,03:361-370+430.
[34]青虹宏.基于数据挖掘技术的客户关系管理系统[J].重庆工商大学学报(自然科学版),2004,04:388-391.
[35]刘峣.房地产企业财务风险控制研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[36]王思思.SNS社区中人际节点空间关系及其影响因素的理论研究[D].河北师范大学,人文地理学,2012,硕士.
[37]曾雪嘉.转不同抗菌肽和几丁质酶基因烟草的抗病性研究[D].西南农业大学,生物化学与分子生物学,2004,硕士.
[38]李璐馨.从释意理论看概念隐喻在同声传译中的可译性[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[39]胡寒.宋本《三国志》通假字浅论[D].复旦大学,汉语史,2012,硕士.
[40]王玉平.高危行业上市公司安全投入水平与市场价值相关性研究[D].山东财经大学,会计学,2014,硕士.
[41]郭晓勋.保险公估人法律制度研究[D].对外经济贸易大学,民商法,2004,硕士.
[42]王永生.方剂辨证论治方法体系之建立[D].黑龙江中医药大学,中医临床基础,2014,硕士.
[43]董泽民.纳米复合界面的构筑及其在光催化中应用的研究[D].华东交通大学,分析化学,2014,硕士.
[44]程松贵.基于DMC1000的萨克斯数控系统研制及VC程序实现[D].合肥工业大学,机械电子工程,2004,硕士.
[45]卢燕飞.拼接图像的被动认证技术研究[D].北京交通大学,2014.
[46]王宏震.低密度SiO_2气凝胶常压制备工艺优化及其废液再生利用[D].长安大学,材料加工工程,2014,硕士.
[47]高詹玉.中职旅游专业体验式教学模式研究[D].广西师范大学,旅游管理课程与教学论,2013,硕士.
[48]赵莹.论司法过程中的下意识因素[D].西南政法大学,法学理论,2012,硕士.
[49]李传业.基于PLC的无糖组培箱微环境CO_2增施监控系统的研究[D].中国农业大学,农业生物环境与能源工程,2004,硕士.
[50]任胜卫.Ⅱ型糖尿病BKS-db/db小鼠角膜病变评估及其相关信号通路的研究[D].青岛大学,眼科学,2014,博士.