神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的研究

【摘要】第一部分大鼠神经干细胞的培养及慢病毒介导GFP转染的实验研究目的原代培养神经干细胞，并在体外继续分裂增殖、稳定传代，慢病毒介导GFP转染神经干细胞后，可做为移植的种子细胞，满足细胞移植需要。材料与方法以健康孕15天Wistar大鼠为实验动物，体外分离并原代培养神经干细胞，之后传代培养，并进行单细胞克隆实验。免疫荧光法和免疫组化SP法对神经干细胞分进行鉴定，Lentivirus介导转染NSCs。结果1．原代培养细胞可形成数十个细胞聚集而成的小神经球(Neurosphere)神经球逐渐增大，7天时神经球已生长成为数百个细胞的大克隆，即可传代培养。传代第7天时已再次长成为数百个细胞聚集的大克隆，将细胞连续传代，细胞的生长模式基本相同。2．原代培养的神经球经分散﹑再扩增得到的大量神经球呈nestin抗原阳性；神经球可以分化为三种细胞，免疫荧光法和免疫组化SP法检测三种细胞分别呈NSE、CNP、GFAP阳性。3．慢病毒介导GFP转染NSCs后，荧光显微镜下观察，可见NSCs携带绿色荧光。结论1．从大鼠胚胎(孕15天)脑组织中分离的神经干细胞在体外可继续分裂增殖、稳定传代，可满足细胞移植需要。2．慢病毒介导GFP转染神经干细胞，标记后的神经干细胞做为移植的种子细胞，便于在动物体内进行跟踪研究。第二部分NSCs移植治疗大鼠血管性痴呆的实验研究目的将慢病毒介导GFP标记的NSCs通过海马立体定向注射的方法移植到血管性痴呆模型大鼠，使海马周围的NSCs数量增加，用Morris水迷宫检测系统对实验大鼠作定位航行试验和空间探索实验测试，检测大鼠的学习记忆能力的改变，观察NSCs移植的治疗效果。材料与方法月龄12～15个月健康成年Wistar大鼠，体重300～400g，用来制备血管性痴呆2VO模型；传代至第6代的Wistar大鼠神经干细胞，GFP标记后于2VO模型造模35天后海马立体定向注射移植，对假手术组、对照组、NSCs移植组海马组织切片做尼氏染色，观察病理学改变；在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）时对移植前后各组大鼠行Morris水迷宫测试，对定位航行实验和空间探索实验结果进行统计分析。结果1．神经干细胞移植1周后，大鼠海马区冰冻切片显示有绿色荧光存在，证明神经干细胞可在海马区域存活、增殖。2．缺血4周时（移植前），NSCs移植组与对照组大鼠各项指标均无显著性差异，但二者与假手术组相比均有显著性差异。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）时，NSCs移植组大鼠逃避潜伏期较对照组均明显缩短（P<0.05），但与假手术组相比仍明显延长；NSCs移植组穿越平台区次数较对照组也明显增加（P<0.05），与假手术组相比仍明显减少(P<0.01)；NSCs移植组大鼠平台所在象限停留的时间百分比较对照组明显增加（P<0.05，移植后12周除外），但与假手术组相比仍明显减少(P<0.05)。3．NSCs移植组尼氏染色显示神经元丢失、变性情况较对照组有明显改善，神经元细胞形态较完整，胞浆内尼氏小体相对较丰富。结论神经干细胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠学习记忆能力。第三部分Notch通路在神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠中的作用研究目的检测神经干细胞移植对VaD大鼠海马区Notch1及Hes1表达的动态改变，研究神经干细胞移植对大鼠学习记忆能力的改善与海马区Notch1、Hes1表达的变化是否相关，探讨Notch信号通路是否参与了神经干细胞移植对血管性痴呆大鼠模型的治疗。材料与方法月龄12～15个月健康成年Wistar大鼠，体重300～400g，用来制备血管性痴呆2VO模型；传代至第6代的wistar大鼠神经干细胞球，GFP转染标记后做为移植的种子细胞，于2VO模型造模35天后海马立体定向注射移植，对假手术组、对照组、NSCs移植组脑组织海马区蛋白样品进行Westernblot检测。结果在缺血9周、13周、17周（移植后4周、8周、12周）的Westernblot检测检测均提示NSCs移植组Notch1和Hes1表达水平较对照组高，有显著性差异（P<0.05），但与假手术组相比仍明显较低（P<0.05）；NSCs移植组3个时间点的Notch1和Hes1表达逐渐下降，呈时间依赖性。结论移植的NSCs激活了Notch1-Hes1通路，该通路可能参与NSCs移植对血管性痴呆大鼠学习记忆能力的修复。第四部分神经干细胞移植治疗对血管性痴呆大鼠突触可塑性的影响目的研究神经干细胞移植治疗血管性痴呆大鼠的过程中是否存在树突与树突棘的形态和结构改变，血管性痴呆大鼠学习记忆能力的改善是否与树突和树突棘的形态和结构改变相关。材料与方法月龄12～15个月健康成年Wistar大鼠，体重300～400g，用来制备血管性痴呆2VO模型；传代至第6代的wistar大鼠神经干细胞球，GFP转染标记后做为移植的种子细胞，于2VO模型造模35天后海马立体定向注射移植，对假手术组、对照组、NSCs移植组脑组织海马CA1区树突的分支及树突棘密度进行统计分析。结果血管性痴呆对照组及NSCs移植组树突分支数目与假手术组相比均明显减少，有显著性差异，随时间延长下降趋势不明显；NSCs移植组树突分支数目与血管性痴呆模型对照组相比有所增加，有统计学意义（P<0.05）。血管性痴呆大鼠模型组和NSCs移植组海马CA1区锥体神经元树突棘密度均明显下降，有统计学意义（P<0.05），NSCs移植组树突棘密度与血管性痴呆模型对照组相比则有所增加，差距有统计学意义（P<0.05）。结论神经干细胞移植增加了血管性痴呆大鼠模型海马CA1区神经元树突的复杂性及树突棘密度，这些改变可能与血管性痴呆大鼠学习、记忆能力的改善相关。
【作者】孙桂芳；
【导师】张博爱；
【作者基本信息】郑州大学，神经病学（专业学位），2014，博士
【关键词】神经干细胞；传代；GFP；VaD大鼠；Morris水迷宫测试；尼氏染色；血管性痴呆大鼠；Notch1；Hes1；Western；blot检测；神经干细胞移植；树突；树突棘；

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