红麻atp9、atp6、atpA基因克隆、功能分析与分子标签发掘

【摘要】发掘克隆红麻细胞质雄性不育相关基因,是阐明CMS分子机理的关键。红麻CMS机理研究为创制新的CMS系提供研究手段,同时为杂种优势利用提供理论依据。本研究以红麻CMS系P3A、保持系P3B以及F1代为材料,采用同源克隆与hiTAIL-PCR方法克隆线粒体能量代谢基因atp6、atp9、atpA全长,通过序列比对,找出了材料间3个能量代谢基因的差异；为了进一步确认红麻CMS系存在的差异片段是否与雄性不育相关,将atp9的3’端的差异区域构建植物表达载体,通过农杆菌介导法转化烟草进行功能验证；基于红麻CMS系中atp9和atp6存在的差异片段,开发了两个能特异区别红麻野败型UG93细胞质的PCR分子标签,并对104份红麻资源进行验证；同时,分析atp6、atp9、atpA基因的差异表达和CDS区的RNA编辑模式,找出这3个能量代谢基因的差异表达与异常编辑位点。获得的主要结果如下：1、采用同源与hiTAIL-PCR方法克隆atp9基因全长,红麻CMS系P3A中atp9全长为1215bp,而相应的保持系P3B为1262bp,通过序列比对,CMS系P3A中的ap9的3’端发生了47bp的缺失；进而分析atp9基因在红麻CMS系,保持系以及F1代花药双核期中差异表达,CMS系atp9的表达水平是其保持系的0.937倍,而F1代是其保持系的1.59倍。2、采用同源与hiTAIL-PCR方法克隆atp6基因全长,红麻CMS系P3A中atp6全长为4892bp,而相应的保持系P3B为4922bp,通过序列比对,CMS系P3A中的atp6的CDS区缺失33bp和插入3bp,进而分析atp6基因在红麻CMS系,保持系以及F1代花药双核期中差异表达,CMS系atp6的表达水平是其保持系的0.963倍,F1代是其保持系的0.987倍。3、采用同源与hiTAIL-PCR方法克隆atpA基因全长,.红麻CMS系P3A及相应保持系P3B中的atpA全长均为3194bp,两者不存在显著的片段差异,只存在碱基之间的差异；进而分析atpA基因在红麻CMS系,保持系以及F1代的花药双核期中差异表达,CMS系atpA的表达水平是其保持系的0.760倍,而F1代是其保持系的1.87倍。4、红麻线粒体基因atp9,atp6,atpA的CDS区RNA编辑模式以红麻同质异核型的5个CMS系K03A,722A,917A,F3A,P3A和同核异质型的CMS系与相应保持系为材料,分析atp9的CDS区RNA编辑模式。结果显示这些材料拥有7个相同的编辑位点(第59th,89th,221th,230th,254th,262th和282th位点),全部为C-U转变,编辑频率为61.5%-100%,第262th位点均创建了一个新的终止密码子,形成PvuI特异酶切位点,酶切图谱显示该位点为完全编辑。这些同质异核或同核异质型材料除了拥有相同的编辑位点外,不同材料还拥有各自的特异完全编辑位点,材料间相同编辑位点不存在明显差异,而特异100%编辑位点存在明显的差异,其中722B,917B,F3B,P3B这4个保持系较不育系具有更多的特异100%编辑位点,这些规律更易于解释育性正常的材料倾向于完全编辑。此外,以红麻不育系P3A,保持系P3B和杂交F1为材料,分析了atp6,atpA基因CDS区RNA编辑模式。结果显示atp6的CDS区发生了43个位点编辑,其中18个发生C-U碱基转换,其余的发生A-G,T-C,A-U,G-A新的编辑形式；在这43个位点编辑中,其中34个作用于密码子的第1、第2位点上,另外3个为共同编辑位点,导致37个氨基酸发生转变；atpA基因CDS区发生了36个位点编辑,仅有10个发生C-U碱基转换,其余的发生A-G,T-C,A-U,G-A,G-U,A-C,G-C新的编辑形式；在这36个位点编辑中,28个作用于密码子的第1、第2位点上,导致24个氨基酸发生转变；同对,atp9、atp6、atpA基因RNA编辑常导致氨基酸发生转变,结果显示色氨酸(S)更易于发生RNA编辑,且易于转变成亮氨酸(L)和苯丙氨酸(F)。这些氨基酸性质的改变多由亲水型转变成疏水型。此外,因F1的恢复基因(Rfs)引入,atp6编辑位点数量及编辑频率都呈递增趋势,在编辑的过程中产生了新的终止密码子。5、基于红麻CMS系中atp9的3’端存在片段差异,构建了4个植物表达载体,采用农杆菌介导法转化烟草进行功能验证。结果显示转化载体MTS-HMI84-GFP和MTS-HM184的阳性植株中出现了不育表型。所有转基因阳性植株中,一些表现为雄性不育和半不育,另一些表现为可育；目的基因在雄性不育植株中有较高的表达量,在可育植株中不表达或微量表达,而在半不育植株中的表达量介于两者之间。转化载体MTS-HM184-GFP的不育植株表现为花药不正常,花粉粒干瘪,碘染不正常着色,果实干瘪,种子发芽率为0%。转化载体MTS-HM184-GFP和MTS-HM184的半不育植株,花药外形正常,碘染正常着色花粉粒为10-50%,果实不饱满,发芽率为58%。这些在育性上发生改变的阳性转基因植株,在农艺性状上也存在差异,苗期出现了变态叶,株高均较野生型植株矮,且生育期足足延后了30-45天。采用绝对荧光定量方法对转基因阳性植株中的目的基因拷贝数进行检测。结果显示,导入MTS-HM184-GFP的阳性单株分别检测到1和2个拷贝的目的基因；导入载体MTS-HM184阳性单株均检测到3个拷贝的目的基因；而在野生型植株中未检测到目的基因。这些初步的研究结果显示,红麻嵌合基因HM184可能与红麻雄性不育相关。6、基于红麻CMS系中atp9和atp6存在的差异,开发了两个能特异区别红麻野败型UG93细胞质的PCR分子标签。通过对104份红麻资源进行分子标签验证,这两个分子标签将这些资源的细胞质划分为不育细胞质与可育细胞质两种类型；而且,从这些资源中共筛选出10个具有红麻野败型UG93细胞质的品种或品系,它们都来源于非洲。
【作者】赵艳红；
【导师】周瑞阳；
【作者基本信息】广西大学，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】红麻；CMS；线粒体；atp9；atp6；atpA；RNA编辑；分子标记；

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