基因连接法和2A策略在水稻Bt基因堆叠中的应用

【摘要】随着Bt转基因作物的广泛种植,一些昆虫在田间条件下对Bt杀虫蛋白产生了抗性。Bt基因堆叠策略指将两个或两个以上Bt基因同时转入植物中表达。它一方面能延缓昆虫抗性,另一方面提高转基因作物杀虫活性,扩大作物杀虫谱。本文先使用基因连接法将Cry1Ac杀虫基因、Cry1Ig杀虫基因(223)和5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抗草甘膦基因(1174)表达框连接并插入T-DNA中,然后使用农杆菌介导法转化水稻。从获得的转化株中筛选到Cry1Ac和223高水平表达且单拷贝插入转化株。最后进一步从后代植株中筛选到纯合子转基因株。纯合子转化株高水平表达Cry1Ac、223和1174基因；对棉铃虫(Helicoverpaarmigera)、二化螟(Chilosuppressalis)、斜纹夜蛾(Spodopteralitura)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)有很好的抗性；对草甘膦也有高水平的抗性。但在基因连接法的实验中发现基因间表达水平差异很大,不利于多基因高表达植株的筛选。且由于T-DNA容量限制无法转入更多的基因。为了克服这些缺点,我们尝试使用2A策略(2Apolycistronictransgene)在水稻中协同表达不同Bt蛋白。2A策略是多顺反子转基因的一个重要的方法。不同基因通过2A编码序列连接(2A上游基因终止密码子删除)并在真核环境中表达时,可以通过融合基因长mRNA表达出不同的单体蛋白。由于不同基因共用一个启动子与终止子,减少了插入序列的大小,同时避免了基因启动子间的同源沉默。本文选用手足口病病毒(FootandMouthDiseaseVirus,FMDV)2A肽段(F2A)和猪捷申病毒(PorcineTeschovirus,PTV)2A肽段(P2A)表达CrylAb和Cry2Ab,设计了两个T-DNA载体1300-Ubi-CrylAbF2ACry2Ab-35Sints-1174(1F2A)和1300-Ubi-Cry1AbP2ACry2Ab-35Sints-1174(1P2A)。同时由于2A上游蛋白C端序列会影响2A的切割效率,于是改变Cry1Ab和Cry2Ab在融合基因上下游的位置,设计了另外两个T-DNA载体1300-Ubi-Cry2AbF2ACry1Ab-35Sints-1174(2F2A)和1300-Ubi-Cry2AbP2ACry1Ab-35Sints-1174(2P2A)。将这四个载体使用农杆菌介导法转入水稻中。对不同T-DNA转基因水稻检测发现2A策略能用于转基因水稻中高水平协同表达Cry1Ab和Cry2Ab杀虫蛋白。根、茎和叶组织WesternBlot检测发现,在水稻不同的组织中也能通过2A肽段实现CrylAb和Cry2Ab高水平协同表达。害虫生物测定发现各T-DNA转化子对棉铃虫、二化螟、斜纹夜蛾和稻纵卷叶螟有很好的抗性。另外为了比较不同2A肽段的切割效率及不同上游蛋白对2A肽段活性的影响,对不同T-DNA转化株Cry1Ab和Cry2Ab蛋白进行定量并分析切割效率。最终发现F2A的切割效率高于P2A,同时Cry1Ab在上游时,2A肽段的效率较高。Cry1Ab和Cry2Ab定量结果同时表明使用2A策略,Cry1Ab和Cry2Ab表达水平与单顺反子转基因(monocistronictransgene)表达水平相当。本文一方面通过传统基因连接法表达Cry1Ac和223杀虫蛋白基因及1174草甘膦抗性基因,最终获得Cry1Ac、223和1174基因高水平表达,单拷贝插入的纯合子转化株。此转化株具有很好的杀虫活性及高水平草甘膦抗性,有转基因商业化种植的潜力。另一方面,针对基因连接法基因间表达水平不同及T-DNA容量有限的问题,本文使用2A策略在水稻中表达Cry1Ab和Cry2Ab。最终证明2A策略可以高水平协同表达不同Bt蛋白同时降低T-DNA大小。在实验使用的四个载体中,1F2A是水稻中表达Cry1Ab和Cry2Ab最佳构建模式。
【作者】赵启超；
【导师】沈志成；
【作者基本信息】浙江大学，农业昆虫与害虫防治，2014，博士
【关键词】基因表达载体；水稻基因；连接法；Bt基因；转化株；切割效率；抗性水平；杀虫蛋白；斜纹夜蛾；DNA；

【参考文献】
[1]黄挺,赵平.电信OSS评估方法研究[J].电信科学,2004,05:36-39.
[2]赵世杰.大型磨齿机数控系统二次开发[D].哈尔滨工业大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[3]闫俊.当代大学生道德知行统一问题研究[D].吉林财经大学,思想政治教育,2014,硕士.
[4]何巍,肖鹏,胡小金,任三元.系留气球球体结构纵向刚度研究[J].力学与实践,2015,01:64-69.
[5]金芳.网络信息资源分类组织研究[D].华东师范大学,情报学,2001,硕士.
[6]周顺晔.激酶双靶点抑制剂的设计及Ⅱ型抑制剂解离通路的研究[D].苏州大学,无机化学,2014,硕士.
[7]费静.企业IPO募资投向变更的动因与短期绩效研究[D].南京理工大学,会计学,2013,硕士.
[8]郭新.基于污染足迹的水环境生态风险研究[D].南京财经大学,数量经济学,2013,硕士.
[9]兰辉辉.安徽服装连锁经营企业物流配送中心信息化绩效评价研究[D].安徽大学,情报学,2013,硕士.
[10]石岩.翼状胬肉发病相关免疫因素分析[D].山西医科大学,免疫学,2002,硕士.
[11]曾鸣,李娜,董军,曾博.基于大安全观的电网运行管理关键技术——关于印度大停电的思考[J].电力系统自动化,2012,16:9-13.
[12]王立.稻草与煤固定床共热解特性研究[D].华东理工大学,化学工艺,2013,硕士.
[13]孟彩莲.大学生中国特色社会主义信仰教育研究[D].河北大学,思想政治教育,2014,硕士.
[14]王双全.加盖岛状皮瓣尿道成形术的临床应用和单因素分析[D].广西医科大学,小儿外科（专业学位）,2013,硕士.
[15]张卫芳.北京市公租房项目REITs模式研究[D].北京建筑大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[16]曹亚南.“幻城”中的百合[D].河北师范大学,文艺学,2012,硕士.
[17]辛泠.俄罗斯共产党的社会主义理论新探索[D].吉林大学,国外马克思主义研究,2014,硕士.
[18]吴亚东.极光的能量沉积和非平衡红外辐射[D].哈尔滨工业大学,动力工程及工程热物理,2013,硕士.
[19]林夏.基于变长模式系统调用序列的主机入侵检测[D].电子科技大学,2004.
[20]何振.我国企业无形资产的培育与管理探究[D].湘潭大学,政治经济学,2001,硕士.
[21]马强.我国政府对非营利组织的监管研究[D].郑州大学,行政管理,2013,硕士.
[22]李浩.发动机机体有限元分析及其冷却风扇CFD仿真优化研究[D].合肥工业大学,车辆工程,2013,硕士.
[23]张建强,薛俊.中心城市外围边缘区的区域协作途径和措施选择——以杭州西南部与富阳东北部为例[J].规划师,2013,08:108-112.
[24]索宝丽.基于虚拟技术的液压综合实验台的研究与应用[D].山东大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[25]薛小廷.A Study on English Vocabulary Level and Vocabulary Learning Strategies of English Majors[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[26]李晋玲.聚羧酸减水剂机理分析及竞聚率的测定[D].中北大学,材料工程,2014,硕士.
[27]张颖.多水平模型在农村已婚育龄妇女生殖道感染研究中的应用[D].北京协和医学院,流行病与卫生统计学,2013,博士.
[28]曾星月.中国生猪养殖规模演进影响因素分析[D].浙江大学,2014.
[29]李放滔.论学校思想道德教育中的体验教育[D].华东师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[30]袁远.自锚式悬索桥稳定性全过程分析和安全性研究[D].长安大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[31]李学军.企业信息化驱动模式与持续优化研究[D].北京交通大学,2007.
[32]刘杨阳.独立董事特征与上市公司关联交易的实证研究[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[33]马静.XP生物公司科技人才股权激励机制研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[34]谭茜.“小人鱼”的童话记忆与现实呼唤[D].杭州师范大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[35]李阳.红旗西路公交枢纽站综合开发的经济性研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[36]李解.海南维多果汁有限责任公司营销策略研究[D].西南交通大学,工商管理,2012,硕士.
[37]高凯.万渝铁路工程项目质量管理研究[D].西南交通大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[38]王丽.要素成本上升背景下的中国出口贸易研究[D].贵州财经大学,国际贸易,2013,硕士.
[39]韦嘉.中学生迷信信念研究[D].西南大学,基础心理学,2013,硕士.
[40]骆健,吴罡明,丁大德.一种高可靠的自适应励磁涌流制动方法[J].电力系统自动化,2010,02:80-83.
[41]李真珍.我国商业银行操作风险度量研究[D].西北大学,金融学,2014,硕士.
[42]王庆.股东优先购买权法律问题研究[D].河北经贸大学,经济法,2013,硕士.
[43]赵珍.地点理论下西安城市社区休闲空间可接近性的演化研究[D].西安外国语大学,人文地理学,2013,硕士.
[44]王乃晶.高中思想政治课教学中学生课程资源开发利用的研究[D].苏州大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[45]张玉海.基于互联网的网络物理教育研究[D].首都师范大学,2001.
[46]孟佳琳.大学生社会主义核心价值体系教育研究[D].沈阳师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[47]李磊.从后现代主义视角解读福克纳作品的哥特风格[D].青岛大学,英语语言文学,2013,硕士.
[48]李陆美.建筑物外立面图像校正技术研究[D].中国地质大学（北京）,电子与通信工程,2013,硕士.
[49]李双.信息技术环境下的农村中学英语课程中探究式学习研究[D].河北师范大学,现代教育技术,2013,硕士.
[50]张敬敬.核桃乳掺假鉴别技术研究[D].河北科技大学,食品科学,2013,硕士.