水稻光温敏雄性核不育基因鉴定与研究
【摘要】水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一,杂交水稻的应用为粮食增产做出了巨大贡献。作为自花授粉作物,杂交水稻的成功得益于雄性不育的利用,包括细胞质雄性不育(cytoplasmicmalesterility,CMS)和核雄性不育(genicmalesterility,GMS)。光敏不育系农垦58S的发现开启了利用光温敏核雄性不育性培育两系法杂交水稻的序幕,迄今已育成100多个两系不育系,极大地推动了两系杂交水稻的应用。但是,对大多数不育系携带的不育基因及其相互关系并不十分清楚,在一定程度上妨碍了两系法杂交水稻的育种和生产应用。本研究首先选取在两系杂交水稻生产中广泛应用的温敏不育系株1S,利用图位克隆方法初步定位了株1S的温敏核不育基因,通过对大量两系不育系及可育品种的分析,确定了温敏不育的候选基因,开发了功能性的分子标记。随后对中国两系杂交水稻生产上曾经或正在广泛应用的光温敏不育系所携带的不育基因进行了鉴定,较全面了解了光温敏核不育基因在两系杂交稻中应用的历史与现状。最后利用亚细胞定位及RNAi技术对温敏核雄性不育基因的分子特征和功能进行了研究。主要结果如下：1、利用2个定位群体和SSR等分子标记将控制株1S的温敏雄性核不育基因定位在第2号染色体上,与RM12521和RM12721分别相距9.93cM和1.46cM。该区间包含了广占63S不育基因的候选位点,且等位性测定表明株1S和广占63S不育基因等位。据此,进一步推测株1S与广占63S一样在RNaseZ(RNZ)基因位点发生了突变。2、通过对14个光温敏不育系和21个野生型可育品种的RNZ测序发现,所有温敏不育材料均携带相同的RNZ突变,自翻译起始的第70-72个核苷酸为终止密码子TAG,定名为RNZm,而可育品种在该位点有2种基因型即TCG(RNZtc)和GCG(RNZgc)。进一步分析发现,携带RNZtc型与RNZm的品种除突变位点之外该基因其余序列完全一致,而RNZge型则在该基因的内含子处含有其它的变异,从而可进一步分为6种组型。3、针对RNZ不同等位基因开发了2个dCAPS标记,对32个光温敏不育系和310个正常可育品种的RNZ基因进行了鉴定。结果表明,RNZm突变只专一的存在于温敏不育系,而携带RNztc和RNZgc的均为野生型品种。通过测序和dCAPS标记验证的材料中,RNZgc类型均比RNZ°类型多。4、根据控制光敏不育的基因(LoC_Os12g36030)的C→G突变,开发了区分光敏(lncRm)和野生型品种(lncRw)的功能性CAPS标记。利用光敏CAPS标记和温敏的dCAPS标记对在生产上曾经或正在广泛应用的两系不育系携带的光温敏不育基因进行了鉴定。结果发现,安农S-1和株1S及其衍生不育系均携带温敏不育基因RNZm,而以农垦58S为唯一不育基因源的衍生不育系中,有携带lncRm或RNZm的,还有同时携带或同时不携带这两个基因的材料。5、根据光敏和温敏不育基因测序或标记鉴定结果,绘制了包含92个两系不育系的光温敏基因演变图。发现我国两系水稻不育系中不育基因的传递与品种系谱存在不一致现象,而育种过程中温敏基因的出现可能是造成光温敏特性变化的重要原因之一。同时,结合两系杂交稻分品种种植面积数据分析,揭示了1993-2012年间我国两系杂交稻中不育基因的利用经历了从光敏到温敏的演化过程,2012年温敏不育系配制的杂交稻已占两系杂交稻种植面积的95%以上。目前温敏不育基因已在两系杂交稻生产中占绝对主导地位。6、根据光敏和温敏不育基因与可育等位基因的序列差异,开发了可用于高通量分型的HRM标记。通过比较4种HRM分型方法,即复制子直接扫描、PCR前加15%WT或MT的DNA、非标记探针分型以及CADMA法,最终确定CADMA方法能很好地区分开两个基因位点的所有基因型,为分子标记辅助育种及种子纯度鉴定提供了一种简便高效的方法。7、通过构建RNZ基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体并在水稻原生质体中瞬时表达,确定了该蛋白定位于叶绿体中。8、构建了RNZ基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导法获得T0代转基因材料,经叶片GUS染色、潮霉素抗性和GUS标记基因的PCR检测,确认2个转基因阳性株系。靶基因定量RT-PCR分析表明,阳性株系表达水平明显下降(35%-45%)。
【作者】张华丽；
【导师】舒庆尧；黄建中；
【作者基本信息】浙江大学，生物物理学，2014，博士
【关键词】水稻；株1S；基因定位；光敏核雄性不育；温敏核雄性不育；RNaseZ；分子标记；光温敏不育系品种演化；HRM；CADMA；RNAi；亚细胞定位；
【参考文献】
[1]寇文龙.地椒口含片制备工艺及初步药效研究[D].陕西中医学院,中药学,2013,硕士.
[2]章长东.我国现有TN低压系统改进措施的刍议[J].电气工程应用.1987(01)
[3]陈仁海.高炉透气指数系统仪表参数设计[J].冶金自动化,1994,04:54.
[4]全永燊,李凤军,黄伟,刘迁,王有为.关于城市交通和城市用地相互关系的讨论[J].城市交通.2006(04)
[5]杜宁宁.生态伦理学的价值取向[D].吉林大学,马克思主义理论与思想政治教育,2004,硕士.
[6]乔倩妃.大跨度铁路斜拉桥车致纵向振动及控制研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[7]魏雪婷.中国漆画与油画绘画语言的比较研究[D].华东师范大学,美术学,2013,硕士.
[8]张国伟.陕西省榆林地区炕围画及其审美特点和艺术价值[D].内蒙古大学,艺术学,2013,硕士.
[9]马新生.随机利率下的离散风险模型[D].华东师范大学,概率论与数理统计,2004,硕士.
[10]温达志,孔国辉,张德强,彭长连,张瑞凤,黎旭.30种园林植物对短期大气污染的生理生态反应[J].植物生态学报,2003,03:311-317.
[11]赵新.蛇葡萄素体外对人膀胱癌J82细胞的抑制作用及机制研究[D].兰州大学,药理学,2013,硕士.
[12]周阳靖.基于环境库兹涅茨曲线假说下的城市河道生态修复研究[D].宁波大学,人文地理学,2014,硕士.
[13]田淑燕.脂肪型脂肪酸结合蛋白在大鼠肝纤维化组织的表达及意义[D].河北医科大学,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[14]周和平.真核表达载体pcDNA3.0-Cx43的构建及其在MSC中的表达[D].第四军医大学,外科学,2004,硕士.
[15]韦武.排气消声器的数值仿真分析[D].大连理工大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[16]赵常青.大庆市龙凤区地热资源热储分布特征及资源量评价[D].吉林大学,地质工程,2012,硕士.
[17]刘香岚.免疫调节分子PDCD4和TIPE2在炎症及肿瘤中的作用[D].山东大学,医学免疫学,2013,硕士.
[18]向云.《福祉的思想》翻译实践报告[D].曲阜师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[19]陈振龙.呼和浩特市国库集中支付改革的研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[20]斯思.miR-27a在红系分化中的作用机制[D].川北医学院,临床检验诊断学,2014,硕士.
[21]郭永清.北美鹅掌楸种子休眠机理及老化特性研究[D].南京林业大学,森林培育学,2004,硕士.
[22]周召均.基于NetFPGA的列车以太骨干网络底层硬件平台的研究与设计[D].西南交通大学,电气系统控制与信息技术,2013,硕士.
[23]王丽丽.《汉语大词典》与《东度记》词语对比研究[D].河北大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[24]吕秋霞.基于WorldFIP的现场总线—电流转换器的开发[D].华北电力大学（北京）,控制理论与控制工程,2003,硕士.
[25]许阳光.拟除虫菊酯类农药对鱼类的安全性评价研究[D].中国农业大学,农药学,2004,硕士.
[26]吴凡,陈东梁,张东胜,信春玲,杨剑锋.石墨烯接枝9,10—二氢—9—氧杂—10—磷杂菲—10—氧化物(DOPO)的功能化合成[J].解放军理工大学学报(自然科学版),2013,05:545-551.
[27]陈秀华.初中科学探究活动实施策略及其有效性研究[D].宁波大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[28]曲春慧.建筑企业信用评价研究[D].浙江大学,2006.
[29]郑美娟.兴凯湖湿地对除草剂净化功能研究[D].吉林大学,环境科学,2013,硕士.
[30]张平,张金宁,王清清,魏取福.聚丙烯腈/氧化石墨烯复合纳米纤维的制备与性能研究[J].高分子通报,2013,07:56-61.
[31]李旸,高正光,李启炎.基于神经网络与遗传算法的数据挖掘体系结构[J].计算机工程,2004,06:155-156.
[32]徐婕.我国高新技术产业融资偏好及其对技术进步的作用[D].东北师范大学,金融学,2012,硕士.
[33]张雪.Annexin A7过表达与小鼠肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的相关性[D].大连医科大学,病理学与病理生理学,2012,硕士.
[34]李玲艳.云芝的化学成分及其药理活性的研究[D].吉林农业大学,生药学,2012,硕士.
[35]周翔.港口企业绩效评价研究[D].大连海事大学,物流工程,2014,硕士.
[36]徐巍华,陈特欢,许超,谢磊,王史春,方小生.基于虚拟仪器的非稳态流管道参数辨识[J].南京理工大学学报,2014,01:22-26.
[37]郭建伟.欠发达地区农村基础教育发展研究[D].浙江海洋学院,农村与区域发展（专业学位）,2014,硕士.
[38]徐振国.基于FPGA的合成孔径雷达回波模拟器控制器的设计[D].哈尔滨理工大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[39]张晨星.陕西高陵扎花艺术研究及其创新应用探索[D].西安工程大学,设计艺术学,2013,硕士.
[40]刘庆云.ERCC1和β-tubulinⅢ在胃癌组织中的表达及其临床意义[D].大连医科大学,肿瘤学,2012,硕士.
[41]陈帅.新疆沙漠旅游竞争力评价[D].新疆大学,旅游管理,2013,硕士.
[42]于洪月.儿童汉语教材《快乐汉语》分析[D].兰州大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[43]刘艳丽.吉化股份公司客户关系管理研究[D].西安理工大学,2002.
[44]胡万年.康德自由思想研究[D].安徽大学,西方哲学,2004,硕士.
[45]张迁.OA期刊站点资源抽取与存储方法[D].燕山大学,计算机技术,2014,硕士.
[46]赵文萍.培养高中生运用数学知识解决物理问题能力的实践[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[47]吕秋月.大连市人肠道病毒71型病原学特征研究[D].大连医科大学,病原生物学,2012,硕士.
[48]陈慧银.南昌职业学院团员信息管理系统分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[49]韩涛.基于DSP的电动汽车用电机控制系统的研究[D].西北工业大学,电力电子与电力传动,2004,硕士.
[50]李天琪.论贿赂的外延—“交易对价说”概念之提倡[D].重庆大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
