PPT1基因调控植物生长发育的研究及叶脉特异表达增强子的分离应用

【摘要】碳代谢不仅在植物本身生长发育过程中起着十分关键的作用,而且亦为其它所有非光合生物提供光合产物,因此在植物科学乃至整个生命科学中,碳代谢及其流向的调控机理一直是研究热点。质体转运蛋白在碳流向中有着至关重要的桥梁作用,而PEP(磷酸烯醇丙酮酸)是植物碳代谢中一个重要的产物,缺少或缺失PEP可能对植物造成致命威胁。拟南芥中编码PEP质体磷酸转运蛋白的AtPPT1基因除了通过转运PEP介导调控叶色、花期以及配子等多个重要植物发育进程外,可能还有独立于PEP之外的生物学功能,但该基因调控这些发育进程的分子机制尚未完全阐明。水稻不仅是一种重要的农作物,而且也是禾本科植物的模式作物。本研究首先利用正向遗传学和反向遗传学研究方法探讨拟南芥中AtPPT1基因在调控根发育中功能及作用机理,并通过不同组织特异型启动子驱动AtPPT1基因过表达或RNAi干涉结构来分析叶色表型和短根表型之间的内在联系,进而利用代谢组学分析突变体根与叶的代谢物变化；同时,采用同源基因克隆法克隆了水稻中的同源基因OsPPT1h,并对其生物学功能进行初步考究；最后,验证了与AtPPTl基因表达模式相关的叶脉特异表达的增强子VVE。取得的主要研究结果如下：1.AtPPT1基因调控拟南芥主根发育利用功能互补实验和RNAi等技术,从正反两方面验证了拟南芥短根与AtPPT1基因功能的内在关联。通过比较cue1突变体与野生型植株的生长速率,表明cuel突变体的种子萌发未受影响,但其主根的生长速度极慢。CaMV35S启动子驱动AtPPT1基因在cuel突变体中过量表达,可以使cue1的主根生长得到完全恢复；同时,CaMV35S启动子介导的AtPPT1基因RNAi转基因株系中,突变体叶色和短根表型同时出现,并与内源AtPPT1基因的表达丰度高度相关。以上结果说明AtPPT1基因除调控叶肉细胞中叶绿素含量外,也参与植物根系发育过程的调控,且这种调控可发生在转录水平上。通过显微观察发现,cue1突变体根伸长区明显短于野生型植株,通过分析细胞分裂标志基因CYCB1;1-GUS的表达活性,显示cuel突变体根的分生能力减弱。采用生长素应答标志基因DR5-GUS检测cue1突变体根中分生区生长素水平,显示突变体中的主根和侧根根尖生长素水平都明显低于野生型植株,说明AtPPT1基因可能通过调节植物体内植物激素进而调控根的发育过程。2.AtPPT1基因通过不同途径调控拟南芥根和叶的发育本研究采用源叶叶脉特异表达AtSuc2基因的启动子,分别驱动表达AtPPT1基因在野生型植株中的RNAi结构和在cue1突变体中的过量表达结构,这两种表达方式都仅仅改变转基因植株的叶表型,对根表型几乎没有影响。然后,采用根特异表达ARSK1基因的启动子分别在植株中驱动表达RNAi结构和在cue1突变体中驱动表达过量表达结构,结果与AtSuc2P启动子驱动的表达结构相互印证。因此,认为受AtPPT1基因调控的叶和根的发育进程是相互独立的,具有不同的调控机制。利用代谢组学手段分析了cue1突变体根和地上部组织的代谢物,结果发现,cue1突变体根和地上部组织中出现的差异代谢物特征不同,在突变体叶组织中,大部分差异代谢物含量要比野生型植株中低；而在突变体根中,大多数差异代谢物含量增加,差异代谢物主要是糖。这表明AtPPT1基因功能缺失在根和叶中引起的代谢改变并不相同,可能由不同的调控途径引起的。3.AtPPT1质体定位肽PTS的作用采用在线预测工具TargetP对拟南芥中两个功能性的转运蛋白进行亚细胞定位预测,结果表明两个蛋白虽都能定位于叶绿体,但AtPPT2叶绿体定位预测的可信度很低。烟草细胞瞬时表达说明AtPPT2不能有效定位到叶绿体膜,而AtPPT1却能很好地定位在叶绿体。将AtPPT1蛋白N端100aa的预测的质体定位信号肽PTS分离出来,分别与eGFP融合和AtPPT2-eGFP融合,结果显示PTS介导的eGFP蛋白及AtPPT2-eGFP复合蛋白都能有效地定位到叶绿体膜。进一步将PTS与AtPPT2-eGFP的融合蛋白导入cue1突变体中,转基因结果显示,PTS介导的AtPPT2-eGFP复合蛋白转基因能有效回复cue1突变叶表型,对照PTS-eGFP融合蛋白以及无PTS的AtPPT2-eGFP复合蛋白不能回复或仅弱回复突变表型。这说明,PTS介导AtPPT1蛋白定位叶绿体膜是该蛋白功能起作用的关键因子之一。4.单、双子叶植物中PPT1基因序列上的异同本研究通过BlastP比对搜索Genbank中水稻蛋白数据库,找到了一条与拟南芥AtPPT1蛋白同源性高达72%的Os09g0297400序列,以该序列为基础并兼顾拟南芥序列,设计兼并引物进行全长cDNA的克隆,获得了一条比Os09g0297400序列短255bp的cDNA序列,记为OsPPT1h。采用类似方法获得的大麦HvPPT1h基因cDNA序列5’端也缺失了195bp序列(与数据库中数据相比)。无论是水稻OsPPT1h还是大麦HvPPT1h的cDNA序列,其缺失序列都是在编码蛋白的N端,对应于AtPPT1蛋白的定位肽区域,而双子叶十字花科的油菜BnPPT1序列(ACD39395)与拟南芥一样都包含N端的定位肽序列。这可能反映出这个基因在单、双子叶不同植物中序列结构上的变异。5.水稻OsPPT1h基因功能的保守性与变异通过农杆菌介导法将OsPPT1h基因的过表达和RNAi(未发现该基因水稻突变体)载体导入水稻日本晴中,两种载体结构分别获得20多份的独立转化株系。田间观察发现,所有获得的T0代转基因过表达植株(编为OX)表型与未转基因植株表型几乎没有差异,继续种植的T1代,所有OX植株表型皆无异常,而DX转基因材料(OsPPT1h基因RNAi转基因)中,除T0代有分蘖表型的几个株系外,还有部分株系在T1代植株出现了分化表型,出现叶脉持绿叶肉失绿和植株矮小分蘖少的地上部表型。RT-PCR结果表明,RNAi转基因植株表型出现是因为OsPPT1h基因表达下调引起的,这说明水稻中OsPPT1h基因除具有与拟南芥AtPPT1基因调控叶色发育的类似功能外,还参与水稻分蘖这个重要农艺性状的发育调控。6.VVE(VASCULARVEINELEMENT)是叶脉特异表达的增强子本研究分离克隆了酰胺酶(amidase,At4g34880)翻译起始位点上游1500bp的调控序列(命名为AmidP)。通过检测GUS报告基因在转基因拟南芥中的表达活性发现,AmidP是个叶脉特异表达启动子。通过一系列功能缺失或获得的研究,发现AmidP叶脉表达特性不可缺少的大小为176bp功能域位于序列5’端起始位置处(-1500至-1324bp),具有增强子表达特性,命名为叶脉特异表达增强子VVE。精细缺失分析发现,一个保守的DOF2-domain是叶脉特异表达的关键所在,其余元件对VVE的特异性和表达强度也都有一定的影响。以2个重复VVE序列与-65CaMV35S片段融合构成复合启动子驱动AtPPT1基因在其突变体cue1中表达,能部分回复突变的叶表型,说明VVE是可以作为增强子用来增加目的基因在叶脉中的表达。
【作者】吴学龙；
【导师】张国平；
【作者基本信息】浙江大学，作物学，2013，博士
【关键词】拟南芥(Arabidopsisthaliana)；水稻(Oryzasativa)；AtPPT1；OsPPT1h；过量表达；RNAi；短根；突变体；转基因；

【参考文献】
[1]刘春炜.基于三维表面匹配的机载LiDAR航带平差方法研究[D].辽宁工程技术大学,摄影测量与遥感,2012,硕士.
[2]张靖.金刚石薄膜N型掺杂的气相动力学过程研究[D].河北大学,光学,2003,硕士.
[3]耿永政.图像语义标注技术中的高效区域分割方法研究[D].西南大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[4]陶璐.试析过士行戏剧创作的风格流变[D].中国艺术研究院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[5]黄琢.基于PID神经网络的多电机同步控制研究[D].东北大学,控制理论与控制工程,2010,硕士.
[6]周高寿.“水晶球”就在您手中数据挖掘的商业应用[J].经济界,2003,06:43-45.
[7]李维亮.Mg-7Zn-xNd镁合金及其半固态组织的研究[D].兰州理工大学,材料学,2013,硕士.
[8]黄可为.RH精炼控制模型[J].冶金自动化,2003,S1:66-69.
[9]涂保东.入侵检测系统的发展历史[J].计算机安全,2003,09:18-21.
[10]张惺.制度环境对企业关系强度的影响[D].吉林大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[11]田智仁.水泥乳化沥青混凝土应用技术研究[D].长安大学,材料学,2014,硕士.
[12]刘士新,王梦光,芦宙新.一种求解多执行模式资源水平问题的遗传算法[J].控制与决策,2001,01:111-113.
[13]段鹏杰.基于射频指纹的室内节点定位方法研究[D].太原科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[14]黄向党.基于车流量的交通灯动态调整策略的研究与设计[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[15]张虎.基于灰色理论的应急预案实施效果评价研究[D].河北大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[16]何彦昕.复杂产品项目WBS绩效研究[D].江苏科技大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[17]李建飞,文志强,胡永祥,邓刘昭芦.基于改进区域生长的遥感影像道路提取[J].计算机工程与应用.
[18]吕海明.利用拉曼散射光谱研究芳香羧酸有机物在TiO_2的吸附机理[D].吉林大学,2013.
[19]邢向前.1927年-1937年南京住宅建设问题研究[D].南京师范大学,中国近现代史,2012,硕士.
[20]马笑潇.智能故障诊断中的机器学习新理论及其应用研究[D].重庆大学,2002.
[21]杨阳.上市公司收益法价值评估参数差异研究[D].北京交通大学,2014.
[22]严蕾.冷轧机组作业预计划技术及应用[J].冶金自动化,2014,04:25-29+36.
[23]张希良.基于下变频技术的软件无线电数字滤波器研究[D].山东大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[24]张坤坤.USP18在干扰素-α治疗慢乙肝过程中的预测意义及作用机制[D].河北医科大学,内科学,2013,硕士.
[25]孔祥勇.柔性防刺经编间隔织物的结构与性能研究[D].江南大学,纺织工程,2012,硕士.
[26]宋巍涛.船舶交流电力系统短路电流计算方法研究[D].东北电力大学,电气工程,2013,硕士.
[27]裘国兴.杭州市中小学生体质健康现状的研究[D].杭州师范大学,学科教学,2011,硕士.
[28]李兴民.安丘安泰玻璃有限公司发展战略研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[29]康怡.声乐学习过程中的模仿与创新[D].西北师范大学,艺术,2013,硕士.
[30]陈丹蕾.基于雷达差分干涉测量与断层自动剖分方法的地震震源参数反演[D].西南交通大学,摄影测量与遥感,2014,硕士.
[31]刘拓.国外高校教学质量监控体系分析及启示[J].高等理科教育,2006,01:83-86.
[32]许悦.漏泄同轴电缆电容计算[D].西安电子科技大学,环境科学,2012,硕士.
[33]贾廷玉.关于IMS MDrivePlus项目本地化翻译的实践报告[D].哈尔滨工业大学,翻译,2014,硕士.
[34]闫润泽.纳米压痕条件下典型红外单晶材料的力学行为研究[D].哈尔滨工业大学,材料学,2013,硕士.
[35]向云.《福祉的思想》翻译实践报告[D].曲阜师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[36]颜拥,文福拴,杨首晖,IainMACGILL.考虑风电出力波动性的发电调度(英文)[J].电力系统自动化,2010,06:79-88.
[37]沙春枝.家具定制连锁企业信息管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[38]凌琳.不同频率重复经颅磁刺激对脑梗死患者运动功能影响的研究[D].南方医科大学,康复医学与理疗学,2012,硕士.
[39]张芳.当代大学生中华民族精神教育研究[D].东北大学,思想政治教育,2010,硕士.
[40]彭博.新中国初期河北省失业问题研究[D].河北师范大学,中国近现代史,2004,硕士.
[41]苏晗程.吉本芭娜娜初期作品中年轻女性的生活方式[D].华中师范大学,日语语言文学,2014,硕士.
[42]余文俊.我国产业集聚与区域差距关系研究[D].天津财经大学,区域经济学,2012,硕士.
[43]张剑峰.牛磺酸、低聚木糖和益生菌对蛋鸡生产及胆固醇沉积的影响[D].南京农业大学,动物营养与饲料科学,2011,硕士.
[44]马万林.花卉图案在湘绣服装设计中的创新应用[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[45]贺宇杰.新课改背景下教学方式变革的文化探源[D].沈阳师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[46]盛骏桢,王亚军,罗希,郑裕国.具有差向选择性还原(R)-6-氰基-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯活性的微生物菌株筛选和鉴定[J].生物加工过程,2013,01:54-59.
[47]梁朝曦.衔接手段在英译中字幕翻译中的应用[D].华中师范大学,外国语言学与应用语言学,2014,硕士.
[48]蒋良孝,蔡之华.时序数据库中的数据挖掘研究[J].微机发展,2003,05:90-92.
[49]白扬.我国上市公司碳会计信息披露影响因素研究[D].中国地质大学（北京）,会计学,2013,硕士.
[50]姜守旭,李建中.一种P2P电子商务系统中基于声誉的信任机制[J].软件学报,2007,10:2551-2563.