家蚕速激肽样肽受体的功能性鉴定和信号转导机制研究

【摘要】速激肽作为神经肽中的一大类,广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物的中枢神经和外周组织中,在生物体内参与调节多种多样的生理功能。在昆虫中,目前已从飞蝗、蟑螂、黑腹果蝇、蚊子等多种昆虫中发现了与速激肽结构相似的神经肽,称为速激肽样肽。与速激肽一样,速激肽样肽主要分布于昆虫神经系统与肠道组织中,参与视觉、嗅觉等神经调控以及促进平滑肌收缩等生理功能。家蚕基因组中编码了六个速激肽样肽,然而关于家蚕速激肽样肽受体及其信号转导机制却鲜有报道。基于已发现的昆虫速激肽样肽受体以及哺乳动物速激肽受体,我们对家蚕基因组数据序列比对和进化分析,发现家蚕孤儿神经肽受体BNGR-A24,-A32和-A33可能是速激肽样肽受体。本文克隆了这三个家蚕G蛋白偶联受体,并利用哺乳动物细胞系HEK293和昆虫细胞系Sf21两套细胞异源表达系统进一步鉴定了这三个家蚕G蛋白偶联受体。通过cAMP和钙离子等功能性检测方法和荧光竞争性结合方法,我们发现BNGR-A24选择性的结合速激肽样肽,是家蚕速激肽样肽受体,命名为BmTRPR。活化后的BmTRPR能特异性结合Gs和Gq蛋白,引起第二信使cAMP和胞内钙离子水平的升高。BNGR-A32和-A33则被证明为与速激肽样肽高度同源的的神经肽Natalisin的特异性受体,分别命名为BmNTLR2和BmNTLR1。此外,我们鉴定了BmNTLR2的16碱基功能缺失突变体BmNTLR2-Δ16,推测BmNTLR2-Δ16在驯化过程中可能存在一定意义。对速激肽受体BmTRPR的功能分析发现,BmTRPR在被配体活化后,能够发生受体的内吞作用。在HEK293细胞中,BmTRPR的内吞过程是一条依赖于网格蛋白,呈浓度梯度依赖型和时间梯度依赖型内吞到早期内含体,并在配体去除后重新回到细胞膜上。通过RNA干扰和特异性抑制剂处理的方法,我们发现BmTRPR受体内吞依赖于GRK5,PKC及PKA的磷酸化,并且在受体磷酸化后能够招募β-arrestin2,介导BmTRPR的内吞。除了受体内吞作用,速激肽受体BmTRPR在被配体活化后能引起与细胞增殖分化密切相关MAPK信号通路的活化。我们在HEK293细胞中,发现BmTRPR可以浓度梯度和时间梯度依赖型激活ERK1/2通路。通过特异性抑制剂处理,我们发现TRP1活化的BmTRPR通过Gs/cAMP/PKA和Gq/PLCβ/PKC的途径介导的ERK1/2磷酸化。此外,EGFR转激活参与介导5min后的ERK1/2磷酸化。另外,利用β-arrestin1/2siRNA特异性沉默HEK293细胞内β-arrestin1/2蛋白,我们发现β-arrestin1/2并不参与调控BmTRPR介导的ERK1/2的活化。根据BmTRPR在细胞水平的功能发现,我们初步探讨其在家蚕生理上的功能。我们发现家蚕速激肽样肽受体表达下调后,家蚕的消化率和生长均受到了一定的抑制,因此推测BmTRPR可能参与调控摄食和消化等生理过程。在此基础之上,我们希望通过后续实验进一步阐明TRP/BmTRPR介导的家蚕生理调控。
【作者】何小柏；
【导师】周耐明；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学及分子生物学，2014，博士
【关键词】家蚕；速激肽样肽；速激肽样肽受体；G_s/G_q偶联；内吞；细胞外调节蛋白激酶；

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