对虾miR-71介导的自噬及白斑综合症病毒（WSSV）编码的miRNA在病毒感染中的作用

【摘要】自从1993年首次爆发以来,对虾白斑综合症病毒(WhiteSpotSyndromicVirus,WSSV)对全世界的对虾养殖业造成了巨大的经济损失。虽然许多科学工作者对WSSV的致病机理进行了探索研究,但是至今也没有有效的方法对其进行防治。研究表明基因表达调控在病毒与宿主互作中起关键作用,而miRNA是调控基因表达的重要方式。MicroRNA(miRNA)是一类长度为22nt左右的非编码RNA,miRNA参与调控几乎所有的生命过程,据报道,至少50%的哺乳动物基因是受到miRNA的调控的。大多数情况下,在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成pri-miRNA,pri-miRNA在细胞核内被Drosha和DGCR8复合体切割成70nt左右的pre-miRNA,后者被Ran和exportin5运送到细胞质中,再被细胞质中的Dicer-TRBP复合体切割成为20-22nt的成熟miRNA双链。大多数miRNA与靶mRNA的识别通过其种子序列(第2-8个碱基)与靶mRNA的3‘UTR结合。成熟的miRNA在Ago的帮助下进入到沉默复合体(RISC)中,其中一条单链在沉默复合体中与靶mRNA通过碱基互补配对的方式结合。近年来,许多研究发现,DNA病毒在感染宿主的过程中会编码病毒自身的miRNA。但是,这些研究几乎全是关于脊椎动物病毒,而有关无脊椎动物DNA病毒编码miRNA的研究非常少。通过miRNA微调基因表达,RNA干扰(RNAi)在病毒-宿主相互作用中起重要作用,许多病毒和细胞的miRNA都参与了病毒的感染。虽然人们对miRNA进行了广泛的研究,但至今没有一个无脊椎动物DNA病毒来源的miRNA在宿主中的转录时相及其作用的全局性研究。为了解决这个问题,我们利用对虾白斑综合症病毒(WSSV)进行了研究。WSSV是一种有305kb的双链环状DNA基因组的DNA病毒,可编码病毒miRNA。基于WSSVmiRNA芯片和Northernblot分析,我们发现WSSV可以编码40个不同的病毒miRNA,其含量密度比人类的大约高360倍。这些结果表明,病毒miRNA的高含量可能是病毒与宿主互作中的基因表达的精细调控有关。转录分析表明,80%的白斑综合征病毒的miRNA在病毒感染的早期阶段均有表达,说明其在表达早期感染过程中有重要作用。试验结果表明,病毒miRNA的生物合成是依赖于宿主的核酸酶Drosha和Dicer1,其功能的行使由Agol介导。进一步研究发现,病毒的miRNA,包括WSSV-miR-211和WSSV-miR-212,有助于WSSV的感染。我们通过研究发现,病毒miRNA(WSSV-miR66和WSSV-miR68)通过抑制病毒基因的表达来促进病毒的感染。在WSSV感染过程中,许多病毒基因的表达被WSSV的miRNA调控。我们的研究为阐明病毒-宿主相互作用的分子机理奠定了基础。MiRNA芯片杂交结果显示,在WSSV感染之后,日本对虾的miRNA表达谱发生了明显的变化,尤其是在无脊椎动物中保守的miR-71出现了明显上调表达,我们推测miR-71可能参与病毒的感染过程。同时,我们发现病毒感染引起宿主自噬(autophgy)活性的改变。因此,miRNA可能通过调控自噬进而调控病毒的感染。自噬是细胞吞噬自身的蛋白或细胞器,并与溶酶体融合,降解受损蛋白或细胞器的过程。自噬是一个受到精确调控的过程,是所有真核生物都具有的细胞维持稳态的共有机制。在细胞的发育和分化过程中,自噬起着至关重要的作用。自噬有一定的肿瘤抑制功能,并可能与延长寿命有关。自噬在先天免疫和适应性免疫中也起着重要作用,如抵抗病菌的侵入。自噬可由各种刺激因素(例如营养物和生长因子的消耗,缺氧,药物和放射治疗)诱导,许多信号转导通路和第二信使参与调控自噬体形成的ATG基因的活性,这些途径汇聚在进化上保守的激酶TOR(雷帕霉素靶点)。此外,也有其他的自噬信号通路独立地起作用,尤其是哺乳动物细胞(例如磷酸肌醇途径)。然而,在哺乳动物细胞中,这些信号传导途径如何诱导自噬的分子机制并不十分清楚。已有的研究表明,一些特定miRNA可以调控自噬的发生。我们利用miRNA芯片,对正常对虾以及注射自噬诱导剂的对虾血淋巴的miRNA表达谱进行分析,结果发现15条对虾miRNA发生明显上调,17条对虾miRNA明显下调。研究发现在病毒侵染后对虾血淋巴的自噬水平明显上升,显示病毒可能通过激活宿主的自噬途径为病毒自身的复制提供便利。进一步研究发现,病毒可通过增强对虾miR-71的表达来调控对虾血淋巴的自噬；miR-71过表达有利于病毒复制,miR-71的敲低会对病毒复制产生不利影响；miR-71的靶基因为免疫相关基因(亲环素基因)。因此,miR-71通过对亲环素基因表达的抑制,诱导细胞自噬,从而促进病毒复制。由此可见,miRNA调控的自噬在病毒感染中发挥着重要作用。
【作者】何耀东；
【导师】章晓波；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】WSSV；miRNA；自噬；病毒感染；

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