绵羊间充质干细胞系的建立及用作体细胞克隆供体的研究

【摘要】自世界首例哺乳动物体细胞克隆羊“多利”培育成功至今,体细胞核移植技术得到日益发展。体细胞克隆中,供体细胞的选择是克隆能否成功的关键因素之一,直接影响到体细胞克隆的效率。迄今为止,已有多种体细胞如各类成纤维细胞、乳腺上皮细胞、生殖系统细胞、淋巴细胞等用作核供体进行哺乳动物体细胞克隆,均获得了成功,但普遍存在克隆效率低、成本高的难题。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于中胚层的成体干细胞,广泛存在于全身结缔组织和器官间质中,具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能。以间充质干细胞为核供体进行体细胞克隆,在猪、牛和狗上已获得成功,在猪上表现出比常规成纤维细胞为供体的克隆效率高。迄今未见有绵羊的相关研究报道。本文首先建立了绵羊脂肪和骨髓间充质干细胞系,对其生物学特征及干细胞特性进行了鉴定,诱导其分化为类神经元、心肌细胞、成骨细胞、成脂细胞和胰岛样细胞,经组织学染色和RT-PCR鉴定,确认表现、表达了各分化细胞特有的形态特征及特异基因。在此基础上,采用骨髓间充质干细胞替代常用的成纤维细胞为核供体,构建重构胚,以成纤维细胞为对照,比较了重构胚的早期发育能力。重构胚移植后,诞生、成活了首例成体干细胞克隆绵羊。主要研究结果如下：1、成功建立了胎儿、幼龄及成年绵羊骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)和脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstromalcells,ADSCs)系。两类间充质干细胞体外生长时均呈长梭形,易形成细胞集落。MSCs细胞生长曲线均呈“S”型,三个发育阶段绵羊P3BMSCs细胞倍增时间分别为30.82±0.05h、30.74±0.03h和31.2±0.06h,胎儿及成年P3ADSCs细胞倍增时间分别为34.02±0.06h和34.10±0.04h,可见不同发育阶段绵羊MSC体外增殖能力基本相近。经RT-PCR鉴定,绵羊MSCs表达了干细胞特有的多能性基因Oct4,Sox2和Nanog,BMSCs不表达CD34、CD45和HLA。2、绵羊MSCs体外长期传代培养,依然保持了较好的遗传稳定性。对传代培养10代(P10)、20代(P20)和30代(P30)的BMSCs和ADSCs进行核型分析,BMSCs和ADSCs核型正常率分别为：P10：90.74%(49/54)和86.05%(37/43)；P20：86.11%(31/36)和84.00%(42/50)；P30：81.63%(40/49)和86.67%(39/45)。3、经多向诱导分化培养,绵羊MSCs可跨胚层分化为神经样细胞、心肌细胞、成骨细胞、成脂细胞和类胰岛细胞。对诱导分化的类神经细胞进行苯胺蓝染色,显示有尼氏体的存在,RT-PCR检测到有神经元特异基因NSE和GFAP的表达;分化的心肌细胞经PAS染色显示胞内存在糖原颗粒,并有心肌细胞特异基因GATA-4和NKX-2.5的表达；茜素红染色可见成骨诱导的细胞被染成深红色的骨结节存在,并有成骨细胞特以及因Osteocalcin和CFBA的表达；油红O染色可见成脂细胞中的脂滴染成红色,并有成脂细胞特异性基因PPAR和Leptin的表达；双硫腙染色证明胰岛样细胞染成猩红色,并有胰岛细胞特异性基因PAX4和Insulin的表达。4、以MSC为核供体、去核卵母细胞为受体构建重构胚。胎儿、幼龄及成年BMSCs重构胚融合率分别为：80.62%、83.43%、78.46%；囊胚率分别为：0.74%、1.71%、0%。胎儿及成年ADSCs重构胚融合率分别为：81.48%、79.23%；囊胚率分别为：1.12%、0%。5、重构胚移植到受体羊,成功诞生了首例成体干细胞克隆绵羊。移植受体母羊20只,怀孕3只；出生成体干细胞克隆羊5只,成活3只。经微卫星DNA亲子鉴定,供体细胞与克隆羊之间的RCP≥99.999%。综上所述,本研究成功建立了绵羊骨髓和脂肪间充质干细胞系,以骨髓间充质干细胞为核供体细胞,成功获得成体干细胞克隆羊。本研究为间充质干细胞的临床医学应用及家畜基因转基因克隆奠定了重要的基础。
【作者】刘宗正；
【导师】张焱如；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物发育生物学与生物技术，2014，博士
【关键词】绵羊；间充质干细胞；诱导分化；体细胞克隆；成体干细胞克隆羊；

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