圆弧青霉脂肪酶的异源表达、耐热性改造及底物专一性分析

【摘要】脂肪酶(EC3.1.1.3)是能够将长链脂酰甘油酯水解的一类酰基水解酶，不仅能在油水界面催化水解反应，还可以在疏水介质中催化转酯、酯化、酯交换等反应。根据脂肪酶的底物专一性，可以将其分为三脂酰甘油脂肪酶和单双脂酰甘油脂肪酶等。三脂酰甘油脂肪酶能将三脂酰甘油酯水解为脂肪酸和甘油，而单双脂酰甘油脂肪酶只能水解单脂酰甘油酯和二脂酰甘油酯。圆弧青霉(Penicilliumcyclopium)PG37可产三脂酰甘油脂肪酶(PcLipI)，也能产单双脂酰甘油脂肪酶(PcMdl)。为了更好地利用这些脂肪酶资源，首先克隆了它们的cDNA序列，并实现了在毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中的异源表达。根据对重组酶酶学性质研究，发现它们的耐热性较差，通过基因工程手段改造了PcLipI以提高其热稳定性。PcMdl的底物专一性不同于PcLipI，通过实验验证其底物专一性后，运用计算机模拟分析了其底物专一性的分子基础。三脂酰甘油酯属于小分子化合物，但是它的水解在rePcLipC(重组热稳定性提高的改造PcLipI)和rePcMdl(重组PcMdl)共同作用时有更好的效果。通过RT–PCR技术获得了PcLipI成熟肽的cDNA序列，其长度为777bp，共编码258个氨基酸。PclipI在毕赤酵母GS115中实现了高效的异源表达。重组毕赤酵母GSL4-7高效表达rePcLipI的培养基初始pH为9.0，甲醇添加量为1.0%，诱导温度为26℃，在此条件下诱导108h产酶水平可达407.3UmL-1。rePcLipI被证实为糖基化蛋白，其表观分子量为31.5kDa。Hg2+、Fe2+和Cu2+抑制rePcLipI的酶活性。rePcLipI的最适pH为10.5，最适温度为25℃，在温度低于30℃和pH7.0~10.5范围内稳定，表明rePcLipI属低温碱性三脂酰甘油脂肪酶，且热稳定性差。rePcLipI的比酶活性为5,300Umg-1。借助同源建模、二硫键预测和分子动力学模拟的方法，预测出能提高PcLipI热稳定性的二硫键。通过定点突变技术获得突变的PcLipI基因，并将其在大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中表达。酶学特性分析的结果表明，大肠杆菌重组突变酶reE-PcLipV248C-T251C和毕赤酵母重组突变酶reP-PcLipV248C-T251C(即为rePcLipC)在35℃下的t1/2分别是对应重组酶reE-PcLip和reP-PcLip的4.5倍和12.8倍。同时，reE-PcLipV248C-T251C和reP-PcLipV248C-T251C比相应reE-PcLip和reP-PcLip的最适温度分别都提高了5℃。通过RT–PCR技术获得了PcMdl完整cDNA序列，提交至GenBank后获得的登陆号为：HM135194。成熟肽cDNA基因Pcmdl在毕赤酵母GS115中实现了异源表达。rePcMdl的表观分子量为39.0kDa。重组毕赤酵母GSM4-2高效表达rePcMdl的条件为：初始pH6.5、甲醇添加量1.5%、诱导温度28℃、诱导时间120h，在此条件下GSM4-2的产酶水平可达215.2UmL-1。rePcMdl经过了糖基化修饰。rePcMdl的最适反应温度为35℃，最适反应pH值为7.5，在35℃以下及pH6.5~9.5之间具有较好的稳定性。Fe3+和Hg2+抑制rePcMdl的酶活性。rePcMdl能催化1-单丁酰甘油酯和1,2-二丁酰甘油酯的水解，不能催化三丁酰甘油酯的水解。rePcMdl水解1-单丁酰甘油酯和1,2-二丁酰甘油酯的Vmax值分别为189.3Umg-1和344.9Umg-1，Km分别为29.1mmolL-1和42.6mmolL-1。借助同源建模、分子对接及分子动力学模拟等方法，对PcMdl底物专一性进行了分析。同源建模构建的活性状态PcMdl，其催化三联体Ser145-Asp199-His259暴露于溶剂中；同时Ser83和Ser145构成氧离子洞，能够稳定催化反应时形成的四面体中间产物。催化口袋由下列氨基酸构成：Tyr21、Phe112、Leu146、Pro174、Val201、Phe256、Val266和Asp267。活性状态下，催化口袋的口部不被盖子覆盖，暴露于溶剂中并有利于底物的进入。利用分子对接及分子动力学模拟，构建了PcMdl与三脂酰甘油酯类似物或二脂酰甘油酯类似物的对接模型。PcMdl中的Phe256将其残基侧链伸向底物结合沟，使得三脂酰甘油酯的sn-1部分进入困难，进而阻碍sn-1的羰基碳原子接近催化三联体中Ser145的Oγ；相反，二脂酰甘油酯能够顺利进入PcMdl底物结合沟并被催化水解。研究了rePcLipC和rePcMdl共同水解油脂的影响因素，同时考察了它们对橄榄油和三丁酰甘油酯的共同水解，并利用HPLC对部分水解产物进行了分析。通过单因素实验确定rePcLipC和rePcMdl共同水解三丁酰甘油酯的最佳温度为30℃，最佳初始pH10.5，最佳酶活性比例为3:1。在最佳温度30℃和恒定pH8.5下，用酶活性比例为3:1的rePcLipC和rePcMdl共同水解橄榄油，水解速度加快，rePcMdl同样能与南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)共同水解橄榄油。rePcLipC和rePcMdl共同水解三丁酰甘油酯，相对于rePcLipC单独作用，随着酶解时间的延长，三丁酰甘油酯逐渐减少，单丁酰甘油酯和二丁酰甘油酯相对含量增加，但增加较少，说明rePcMdl加速了rePcLipC催化的水解产物的水解。
【作者】谭中标；
【导师】邬敏辰；
【作者基本信息】江南大学，发酵工程，2014，博士
【关键词】脂肪酶；异源表达；定向改造；热稳定性；底物专一性；协同作用；

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