系统代谢工程改造光滑球拟酵母生产3-羟基丁酮

系统代谢工程改造光滑球拟酵母生产3-羟基丁酮

作者:师大云端图书馆 时间:2015-09-06 分类:毕业论文 喜欢:4123
师大云端图书馆

【摘要】本论文以丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(Candidaglabrata)CCTCCM202019为研究模型,借助基因组规模代谢网络模型(Genomescalemetabolicmodel,GSMM)、代谢工程、辅因子工程、及亚细胞代谢工程等生物学方法,从系统生物学水平上研究改变光滑球拟酵母丙酮酸代谢流量对目的产物积累的影响。同时,本文也研究了光滑球拟酵母抵御3-羟基丁酮胁迫的耐受机理,为提高微生物抵御3-羟基丁酮耐受能力提供了研究方向和改善途径策略。主要研究结果如下:1.借助光滑球拟酵母基因组规模网络代谢模型iNX804设计并确定胞质丙酮酸脱羧途径是C.glabrata高效合成3-羟基丁酮最优代谢途径之一。结合特定约束算法,模拟分析途径关键酶乙酰乳酸合成酶(acetolactatesynthase,ALS)和乙酰乳酸脱羧酶(acetolacetatedecearboxylase,ALDC)对3-羟基丁酮合成的影响,发现:与野生菌株相比,丙酮酸脱羧途径可使3-羟基丁酮理论合成产率提高至了0.24mmol-1gDCW-1h-1。基于模拟分析结果,借助代谢工程策略成功构建胞质丙酮酸脱羧途径,使3-羟基丁酮产量从40mgL-1提高至1.14gL-1,表明模型iNX804的预测具有一定的准确性。在此基础上,通过启动子优化、竞争途径抑制和胞内辅因子水平调控等优化策略,使C.glabrata积累3-羟基丁酮的能力提高至3.67gL-1。2.利用酿酒酵母线粒体信号肽(CoxIV)介导的定位作用,结合代谢工程策略成功在光滑球拟酵母线粒体中构建异源丙酮酸脱羧途径,实现了线粒体脱羧途径合成3-羟基丁酮的代谢目标。与胞质途径相比,线粒体丙酮酸脱羧途径中3-羟基丁酮对丙酮酸得率、3-羟基丁酮产量及其对细胞得率分别提高了13.3%、16.1%和20%。在此基础上,过量表达线粒体丙酮酸转运蛋白(mitochondrialpyruvatecarrier,MPC)可使线粒体丙酮酸的转运速率提高97%,从而增加线粒体丙酮酸的浓度,强化线粒体丙酮酸脱羧途径合成3-羟基丁酮的能力,使线粒体丙酮酸脱羧途径合成3-羟基丁酮的产量及其对丙酮酸得率分别提高至3.26gL-1和0.19gg-1。3.借助微生物代谢网络及其调控信息,采用乙醛和硫胺素(VB1)为代谢扰动条件,在全面分析不同扰动条件下对细胞代谢产物影响的基础上,确定乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ALD)、乙醛脱氢酶(acetaldehydedehydrogenase,ADH)及丙酮酸脱羧酶(PDC,pyruvatedecarboxylase)是调控丙酮酸裂解途径(carboligaseactivityreaction,CAR)合成3-羟基丁酮的关键代谢节点。借助代谢工程策略(基因过量表达或敲除),使C.glabrata丙酮酸裂解途径合成3-羟基丁酮能力提高至2.24gL-1。同时,通过模型iNX804对代谢流量的模拟分析和胞内氧化还原平衡的分析,确定胞内NADH水平是限制CAR高效合成3-羟基丁酮的一关键因素。基于此,借助系统代谢工程和辅因子工程等改造策略,使光滑球拟酵母合成3-羟基丁酮的能力进一步提高至7.33gL-1。4.通过研究3-羟基丁酮对光滑球拟酵母生理特性的影响,发现:高浓度3-羟基丁酮可有效降低光滑球拟酵母细胞活力,抑制细胞生长,提高胞内活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平和抑制胞内能量代谢(Adenosinetriphosphate,ATP)能力,从而加速诱发细胞凋亡和死亡。基于此,借助RT-PCR技术和分子生物学手段研究了线粒体融合分裂过程对细胞生理特性的影响,结果表明:增强线粒体融合过程可延缓胞内ROS产生、增强胞内ATP合成能力,维持线粒体膜电位的动态稳定平衡,显著提高C.glabrata抵御3-羟基丁酮胁迫的能力。这一结果表明,改善线粒体生理功能可有效提高微生物细胞抵御外界环境胁迫的能力。
【作者】李树波;
【导师】陈坚;
【作者基本信息】江南大学,发酵工程,2014,博士
【关键词】光滑球拟酵母;3-羟基丁酮;基因组规模网络代谢模型;系统代谢工程;辅因子工程;亚细胞代谢工程;线粒体;线粒体融合分裂过程;

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