Clostridium bolteae D-阿洛酮糖3-差向异构酶的蛋白质工程与食品级表达

【摘要】糖尿病是一种世界性新兴的疾病，其发病率激增，预计在未来将会更迅速的增长。多数糖尿病患者伴有肥胖、脂肪肝及心脑血管疾病等并发症，这些并发症严重威胁人类的健康。研究表明，单一糖类消耗成为糖尿病发病的主要因素之一。因此，利用低血糖应答的甜味剂代替蔗糖成为预防糖尿病的有效方法。D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3位差向异构体，是一种己酮糖甜味剂，属于稀有糖。D-阿洛酮糖的甜度为蔗糖的70%，但其能量仅为蔗糖的0.3%，是食品中理想的代糖品。D-阿洛酮糖具有降低血糖、降低血脂、清除活性氧自由基和神经保护等重要的生理功能。在食品加工过程中，可改善凝胶特性并可产生良好的风味。D-阿洛酮糖在天然产品中存在较少，但生物催化新技术的开发使D-阿洛酮糖的大规模生产成为可能。D-塔格糖3-差向异构酶家族酶可催化醛酮糖C-3位的差向异构，从而实现D-果糖向D-阿洛酮糖的转化。D-塔格糖3-差向异构酶家族酶因其底物专一性的不同，被分为D-塔格糖3-差向异构酶（DTEase酶）和D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPEase酶）两类。本研究前期利用鲍氏梭菌（Clostridiumbolteae）ATCCBAA-613进行全细胞反应，确定该菌株具有催化D-果糖差向异构生成D-阿洛酮糖的能力，无副产物产生。在此基础上，对该鲍氏梭菌（C.bolteae）ATCCBAA-613全基因组中预测的DPEase酶基因进行克隆、表达；对DPEase酶进行分离纯化、酶学性质、构效关系及分子改造等方面进行研究；实现DPEase酶在食品级宿主枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis中表达，并分别基于Cre/lox系统和反向筛选标记mazF基因，成功构建食品级表达系统。具体包括以下几部分内容：1.利用PCR的方法扩增获得C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase的基因序列，利用pET-22b（+）表达载体，构建重组质粒，转化表达宿主Escherichia.coliBL21（DE3），成功构建重组菌株E.coliBL21/pET-22b（+）-CLOBOL00069。2.对重组菌株E.coliBL21/pET-22b（+）-CLOBOL00069的诱导表达条件进行研究。结果表明在对数生长中期OD值为1.0左右后，加入终浓度为5g/L的乳糖，20°C条件下诱导7h，可达到最大酶活，为6.1U/mL发酵液。利用重组菌株E.coliBL21/pET-22b（+）-CLOBOL00069全细胞进行转化。经鉴定，产物为D-阿洛酮糖，说明C.bolteaeATCCBAA-613的DPEase基因在E.coliBL21中表达正确并具有转化D-果糖为D-阿洛酮糖的能力。3.利用Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow亲和层析柱和Superdex20010/300GL凝胶柱对C.bolteaeDPEase酶进行分离纯化，其亚基分子量约为34kDa，酶蛋白分子量为139kDa，证实来源于C.bolteae的DPEase酶为四聚体酶。C.bolteaeDPEase酶是金属蛋白酶，Mn2+和Co2+可显著增强酶活。当Co2+浓度为0.4mmol/L时，C.bolteaeDPEase酶获得最大酶活。4.C.bolteaeDPEase酶的最适反应pH为7.0，在pH6.57.5之间其相对酶活较高，表现出良好的活性。最适反应温度为55°C，在45°C以下，该酶较稳定，当温度大于50°C时，酶的热稳定性较差。在Co2+存在的情况下，酶的热稳定性显著提高。55°C时，Co2+的添加可使酶的半衰期延长至原来的3.6倍。5.研究C.bolteaeDPEase酶的底物特异性，发现该酶对D-阿洛酮糖的底物特异性最高，D-果糖次之，其次为D-塔格糖，而对磷酸化的糖基本没有作用。并测定该酶的动力学常数，当以D-阿洛酮糖作为底物时，其Km、kcat和kcat/Km分别为27.4mM、2935min-1和107.1min-1mM-1。该酶对D-阿洛酮糖的Km值远小于其他底物，催化效率kcat/Km较其他底物更大，其说明其对D-阿洛酮糖的亲和性更高，其最适底物是D-阿洛酮糖。因此该酶被鉴定为D-阿洛酮糖3-差向异构酶。6.利用已有的晶体结构信息，利用SWISS-MODEL对C.bolteaeDPEase酶单体的结构进行模拟，利用Discoverystudio软件对C.bolteaeDPEase酶和D-果糖进行对接，获得位于活性中心的关键氨基酸位点为Glu158，His188，Arg217，Glu152，Glu246，Y68和G109。突变结果表明，Glu152和Glu246为催化活性中心关键氨基酸，Glu158，His188和Arg217与底物结合有关，68和109位的氨基酸与底物识别有关，影响活性口袋的形成。并成功构建双突变体Y68I/G109P，该突变体酶对D-果糖的亲和能力更高，具有更好的热稳定性。7.利用B.subtilisWB800对C.bolteaeDPEase酶进行表达，成功构建重组菌株B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。该重组菌株无需诱导即可产生DPEase酶，18h时酶活可达到6.8U/mL。该酶最适pH为7.0，最适温度为60°C，与E.coli表达的DPEase酶酶学性质相似。结果表明，DPEase酶可在B.subtilis中的表达。8.利用Cre/lox系统成功构建食品级重组菌株B.Subtilis/lox-DPE，获得的最高酶活可达6.5U/mL发酵液（B.subtilis1A751/lox-DPE）。其OD600值可达12左右，远高于重组菌B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。在启动子P43的作用下，C.bolteaeDPEase酶基因在对数期及稳定期均可高效迅速的表达。9.利用mazF基因作为反向筛选标记，成功构建食品级重组菌株B.subtilis/DPE，获得最高酶活可达6.4U/mL发酵液（B.subtilis1A751/DPE），与重组菌B.subtilis/lox-DPE和重组菌B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe的最高酶活相差不大。其OD600值可达12左右，与重组菌B.subtilis/lox-DPE相同，远高于重组菌B.subtilisWB800/pMA5-cbdpe-Y68I/G109P。
【作者】贾敏；
【导师】张晓鸣；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】D-阿洛酮糖3-差向异构酶；Clostridiumbolteae；蛋白质工程；食品级表达；

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