钾离子通道在鲈鱼巨噬细胞中非特异性免疫功能研究

【摘要】钾离子通道是细胞膜上控制钾离子进出的孔道,几乎存在于所有类型的细胞中,在细胞生物学范畴内是种类最多,分布最广的离子通道。。钾离子通道在非免疫细胞信息传递、细胞分泌、增殖、分化和维持正常功能等方面发挥着重要作用。之前,在几种哺乳动物如仓鼠和人中克隆得到了大量的钾离子通道基因。但是在低等生物特别是鱼类中的相关研究很少,特别是对于钾离子通道有多少种类型,在免疫细胞中发挥着何种作用等科学问题的研究几乎无人进行。众所周知,非特异性免疫应答机制是鱼类等海洋生物应对外来病原体侵染的主要应对方式,离子通道被证实在哺乳动物巨噬细胞激活中发挥着重要作用,但是离子通道在免疫应答过程中的调控功能的研究在国际海洋生物学领域基本上还是空白。本研究以花鲈(Lateolabraxjaponicus)为样本,采用分子生物学、生物化学等技术手段,从不同类型的钾离子通道基因家族入手,首先克隆了分别归属于电压门控型钾离子通道(Kv)shaker和shaw家族的4种类型的钾离子通道基因全长序列(spKvl.1,spKv1.2,spKvl.5和spKv31),研究了这几种基因在鲈鱼不同组织的分布和在LPS刺激条件下在腮、脾脏、头肾、肝脏、肌肉、脑、肠、皮肤、血液等9种组织中不同时间段的表达情况。研究发现,在鲈鱼感染后spKv1.1、spKv31基因的表达量在头肾、血液等免疫相关组织器官中大量增加,表明这两种钾离子通道与鱼类免疫相关器官组织的功能发挥有着明显的关联性。随后在对鲈鱼巨噬细胞进行了原代培养的基础上,研究了spKv1.1,spKv1.2,spKv1.5和spKv3.1基因在LPS刺激下和LPS与钾离子通道阻断剂TEA共同作用下的表达情况。结果表明,这4种基因在LPS刺激2小时后表达量全部升高,其中spKv1.2和spKv1.5的表达量升高了将近6倍,spKv1.1的表达量升高了近35倍。由于先天性免疫防御为鱼类主要的免疫反应,在抗微生物侵染的过程中首先启动,所以结果提示,上述离子通道,特别是spKvl.1积极参与了鲈鱼巨噬细胞的先天性免疫防御过程中。研究还发现,在LPS与钾离子通道阻断剂TEA共同作用下,spKv1.5表达量先被抑制而后急速上升,说明spKv1.5可能存在反馈调节机制,以应对通道阻断剂的负面影响。本研究还开展了电压门控型钾离子通道阻断剂TEA和4-AP对IL-1β、TNFα等免疫细胞因子基因的表达、巨噬细胞增殖、巨噬细胞呼吸爆发等非特异性免疫功能的影响研究。研究发现,LPS刺激后IL-1β、TNFα基因的表达量大幅上升,而在LPS和通道阻断剂共同作用下4h之前细胞因子基因的表达量还不如LPS处理组中上升迅速,但在4h到12h之间,细胞因子基因的表达量却迅速上升,增长量达4-7倍。先前,在哺乳动物细胞中通道阻断剂对免疫细胞因子的表达有抑制与反馈作用,而我们的研究结果对哺乳动物的研究结果做了进一步的证实,提示在鱼类中也可能存在类似的机制。。随后的生理学实验表明,钾离子通阻断剂对鲈鱼巨噬细胞的增殖和呼吸爆发活性有明显的抑制作用,提示巨噬细胞正常功能的发挥与钾离子通道的活性有明显的关联性。上述结果说明：电压门控型钾离子通道参与了鲈鱼巨噬细胞的非特异性免疫反应,不同类型的钾离子通道基因的表达量的变化存在程度上的差异,提示其在不同的阶段可能执行不同的生理功能。而在克隆得到的4种钾离子通道中,spKv1.1在免疫反应中可能发挥着更为积极的作用。本项研究的结果丰富了海洋鱼类免疫学的内容,为鱼类养殖的防病抗病提供了理论依据。
【作者】丛柏林；
【导师】张全启；黄晓航；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，博士
【关键词】电压门控型钾离子通道；巨噬细胞；免疫功能；鲈鱼；

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