半滑舌鳎生殖细胞标记基因的克隆、表达及调控区功能验证

【摘要】原始生殖细胞（PGCs）是生殖细胞的祖细胞，在胚胎发育的早期形成后迁移到性腺原基，成为性原细胞，并最终发育成两性配子。近年来，由于对性别分化机制研究的不断深入，生殖细胞的发生发育和分化日益成为科学研究的热点。鱼类生殖细胞标记基因的研究将为深入开展鱼类生殖细胞发生发育、迁移和性别分化研究奠定坚实基础，同时对鱼类种质资源保存和繁殖育种都具有重要的理论意义和应用价值。然而目前海水养殖鱼类生殖细胞标记基因的相关研究较少。半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）是我国重要的海水养殖经济鱼类。而半滑舌鳎雌鱼比雄鱼生长快且个体大，在养殖条件下生理雌鱼比例低、不能自然产卵且产卵量有限，限制了舌鳎养殖业的快速发展。全雌苗种的培育和代理繁殖技术可以解决上述问题，但是对半滑舌鳎性别分化机制缺乏深入了解和生殖细胞标记基因的研究非常有限，成为制约相关研究开展的重要因素。本研究通过RACE和PCR结合的方法克隆了半滑舌鳎生殖细胞标记基因vasa、nanos、dnd和pou2全长cDNA和DNA序列，分析这些基因的序列特征。通过荧光定量PCR分析这些基因在胚胎发育过程、成鱼各组织以及伪雄鱼性腺的表达特征，着重研究这些基因在性腺分化期雌雄性别表达差异，初步探讨它们的功能，并利用原位杂交技术研究vasa、nanos和dnd基因在生殖细胞发育中的表达情况；同时采用染色体步移和PCR扩增技术克隆了vasa、nanos、dnd和pou2基因5’和3’调控序列，并通过在线软件预测这些基因启动子潜在的转录因子（TF）结合位点，进而构建vasa和nanos基因调控序列与绿色荧光蛋白（GFP）基因的融合表达载体并在模式鱼青鳉上采用转基因和RNA定位表达技术验证了其功能。本研究为半滑舌鳎原始生殖细胞的标记和操作（分离、冷冻保存和移植等）奠定了基础，同时为半滑舌鳎的性别分化机制和生殖细胞发生发育研究提供了基础资料。主要研究结果如下：1.序列分析结果表明，半滑舌鳎Vasa氨基酸序列（CsVasa）具有DEAD-box家族蛋白8个保守基序；进化分析显示CsVasa属于硬骨鱼类Vasa蛋白分支并和塞内加尔鳎聚在一起。原位杂交结果表明半滑舌鳎vasa基因（Csvasa）在生殖细胞中特异表达。定量PCR结果显示Csvasa主要在性腺中表达，在伪雄鱼性腺的表达量显著低于正常雌雄鱼性腺，在胚胎发育中表达量总体呈逐渐降低的趋势，Csvasa基因在性别分化期的表达呈典型的性别二态性。2.预测Csvasa基因5’侧翼序列（5.2kb）的一些典型的TF结合位点，进而构建pCsvasa-GFP-T和GFP-Csvasa3’UTR质粒，通过显微注射技术发现Csvasa启动子具有驱动GFP转录的功能和Csvasa3′UTR能够标记青鳉发育过程中的PGCs。3.舌鳎Nanos序列（CsNanos）分析发现其序列具有两个保守的CCHC锌指结构域，进化分析表明CsNanos归为Nanos2分支。原位杂交结果显示Csdnd主要在性腺生殖细胞中表达。荧光定量PCR结果表明Csnanos在性腺中表达量最高，其次是肝脏，其余组织的表达量相对较低，伪雄鱼表达量显著低于正常雌雄鱼，胚胎发育期呈现先升高后降低的表达趋势，Csnanos在性别分化期呈现性别二态性表达特征。4.预测Csnanos基因5’侧翼序列（3.7kb）TF结合位点，构建了GFP-Csnanos3′UTR载体，体外合成融合GFP和Csnanos3′UTR的杂合mRNA，通过显微注射技术发现Csnanos基因3′UTR能够标记青鳉胚胎发育过程中的PGCs。5.半滑舌鳎Dnd序列（CsDnd）分析发现其包含RNA识别基序RRM、CR1~4、NR在内的6个保守基序，进化分析显示CsDnd属于Dnd家族硬骨鱼分支。获得舌鳎dnd基因（Csdnd）5’侧翼序列2.7kb和3’侧翼序列1.8kb，分析了半滑舌鳎Csdnd5’侧翼序列潜在TF结合位点。原位杂交结果显示Csdnd在性腺生殖细胞中特异表达。定量PCR结果表明，Csdnd主要在性腺中表达，伪雄鱼性腺Csdnd表达量显著低于正常雌雄鱼，Csdnd在胚胎发育过程中呈降低的趋势，Csdnd在性别分化过程中呈性别二态性表达特征。6.舌鳎Pou2序列（CsPou2）分析发现其包含Pou家族的POUs和POUh两个保守结构域，进化分析显示CsPou2归为Pou家族的Pou2分支。获得舌鳎pou2基因（Cspou2）5’侧翼序列4.1kb和3’侧翼序列1.7kb，在线分析了Csdnd5’侧翼序列潜在TF结合位点。定量PCR结果显示，Cspou2表达主要分布在雌鱼性腺中，在雄鱼和伪雄鱼性腺几乎检测不到，Cspou2在胚胎发育过程中表达量也呈降低的趋势，性别分化期呈性别二态性表达特征。
【作者】黄进强；
【导师】陈松林；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，博士
【关键词】半滑舌鳎；原始生殖细胞；性别分化；vasa；nanos；dnd；pou2基因；

【参考文献】
[1]杨春旭,李宪奎,宋庆奎.弧形连铸机结晶器振动装置偏心距[J].一重技术.1998(04)
[2]王炜.基于卡尔曼滤波的多区域关联视频目标跟踪研究[D].南京理工大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[3]龚金龙.籼、粳超级稻生产力及其形成的生态生理特征[D].扬州大学,作物栽培学与耕作学,2014,博士.
[4]杜红娟.FOLFIRI方案二线治疗晚期胃腺癌的疗效和安全性的临床分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[5]姜健.路由器拥塞控制中RED算法的优化研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[6]李仁璞,王正欧.基于粗集理论和神经网络结合的数据挖掘新方法[J].情报学报,2002,06:674-679.
[7]马林.“省管县”对郑州发展的影响及对策研究[D].郑州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[8]段丽华.带扩散干扰风险模型中破产概率分布的研究[D].大连海事大学,应用数学,2004,硕士.
[9]尹本丰,张元明.冻融过程对荒漠区不同微生境下齿肋赤藓渗透调节物含量和抗氧化酶活力的影响[J].植物生态学报,2015,05:517-529.
[10]DAUHOOB.Aminah.中国大连系统性红斑狼疮患者的临床及免疫学特征[D].大连医科大学,风湿免疫,2012,硕士.
[11]江平开,黄兴溢,吴超,虞景洪,彭鹏.导热聚合物电介质复合材料进展[A].中国电工技术学会工程电介质专业委员会.第十三届全国工程电介质学术会议论文集[C].中国电工技术学会工程电介质专业委员会:,2011:9.
[12]刘念东.非公有制企业共青团组织的角色定位及发展研究[D].苏州大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[13]慕春棣.对控制教育的挑战IFAC第四次控制教育研讨会(ACE’97)综述[J].自动化学报,1998,02:143-145.
[14]苏琳.初级职称护理人员专科理论培训内容的研究[D].中国人民解放军医学院,护理学,2013,硕士.
[15]何占琦.含分布式电源的地区电网供电可靠性评估研究[D].广东工业大学,电气工程,2014,硕士.
[16]时志芳.移动投诉信息中热点问题的自动发现与分析[D].北京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[17]李盼.金属与非金属粘接结构微声激励融合检测技术[D].中北大学,检测技术与自动化装置,2012,硕士.
[18]申洪伍.科学鉴定在突发公共事件处置中的运用[D].西南政法大学,侦查学,2012,硕士.
[19]施思.青贮饲料添加剂及环境微生物产纤维素酶的研究[D].西南民族大学,基础兽医学,2013,硕士.
[20]王灿.重大突发事件中微博意见领袖研究[D].河北大学,新闻学,2014,硕士.
[21]阳光.联合副动式复合动词结构语义研究[D].内蒙古师范大学,少数民族语言文学,2013,硕士.
[22]李中伟,佟为明,刘勇.PCIDeviceNet板卡和短窗Morlet复小波在继电保护测控系统中的应用[J].电力系统自动化,2006,07:93-97+107.
[23]唐家麒.“高送转”股利分配政策信号传递作用研究[D].复旦大学,财务管理,2012,硕士.
[24]朱敏.包覆加气片材钢管柱的抗火研究[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[25]巫庆辉,伦淑娴.基于定转子电阻误差补偿的感应电动机自适应逆解耦控制研究[J].自动化学报,2010,02:297-303.
[26]鄢红玲.高效液相色谱及电化学技术检测几种药物生物小分子[D].湖南师范大学,药物分析学,2014,硕士.
[27]张靖.易门县烤烟节水灌溉技术研究[D].湖南农业大学,作物学,2012,硕士.
[28]潘国友,倪坤如,刘坤庭.湘钢1号高炉改造性大修设计[J].炼铁.1996(05)
[29]孙妍峰.我国网络原创文学的版权问题研究[D].河北大学,传播学,2014,硕士.
[30]鲍轩.基于Android手机音视频监控的软件研发与同步实现[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[31]杨萍,丁健忠,马春,夏林悬,丁期峰,何杰.绿色合成金颗粒负载石墨烯复合材料及其电催化性能研究[J].宿州学院学报,2014,12:79-81+91.
[32]郭彩霞,乔国刚,姜雪强,史磊磊.盾构隧道下穿既有桥梁综合控制技术[J].市政技术,2014,05:87-89+93.
[33]刘臻.城市公共自行车运营中的多车场车辆调配优化研究[D].北京交通大学,2014.
[34]王菲.施氏假单胞菌N2对含氧多环芳烃的生物降解特性研究[D].西安建筑科技大学,环境科学,2013,硕士.
[35]王慧忠.亨德尔《弥赛亚》中男高音独唱分曲研究[D].武汉音乐学院,音乐与舞蹈学,2013,硕士.
[36]蒋微青.“以人为本”视角下的中国经济包容性增长水平测度研究[D].河北经贸大学,统计学,2014,硕士.
[37]曹旭敏.银行服务系统排队问题研究[D].宁波大学,企业管理,2012,硕士.
[38]鲍晋军.指纹识别若干技术的研究[D].浙江工业大学,2012.
[39]李佳.秦汉三国时期山西武术发展状况的研究[D].中北大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[40]臧培青.农村中小学书香图书管理系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[41]郑宏建,余宗敏.舰空武器系统发展特点分析[J].飞航导弹.2004(06)
[42]王晶.基于多端口等值的电压稳定在线监视及切负荷控制研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2014,硕士.
[43]乔丽.猎头公司推荐成功率研究[D].西安工业大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[44]逯圣路.CaZr_(1-x)In_xO_(3-α)的制备及在铝液测氢中应用[D].东北大学,化学工艺,2010,硕士.
[45]马志杰.生物型人工全髋关节置换术治疗青壮年强直性脊柱炎的疗效分析[D].遵义医学院,骨外科学,2014,硕士.
[46]刘敏.高速铁路列车运行图优化和评估研究[D].北京交通大学,交通运输规划与管理,2014,博士.
[47]朱天垣.335例子宫内膜异位性疾病治疗效果观察[D].兰州大学,儿少卫生与妇幼保健学,2012,硕士.
[48]姚芬花.“一对一”个性化教学模式在小学语文教学中的应用[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[49]白云峰.智能化奶牛生产管理系统的研究与建立[D].东北农业大学,2004.
[50]颜小聪.材料特征对阅读障碍儿童视知觉的影响[D].湖南师范大学,基础心理学,2013,硕士.