产油酵母菌合成生物油脂的研究

【摘要】微生物油脂是一种新兴的可再生资源，能在应用于多个工业领域，特别是在生物柴油的制备方面潜力巨大。产油酵母菌在发酵过程中能累积较大的生物量，利用的原料广泛，受到研究者的极大关注。但酵母菌油脂的研究仍存在一些问题，使得酵母菌油脂距真正的工业化生产还有一定距离。目前，但我们对于酵母菌中油脂代谢的全局性调控仍然知之甚少；目前尚未找到适合微生物油脂生产且能够稳定获取的廉价原料；酵母菌油脂发酵难以获取足够多的生物量，导致油脂的整体产量偏低；微生物油脂分泌的研究极具前景，但已有的研究极少。基于酵母菌油脂的研究的上述不足，我们进行了针对性的研究。基于同源重组的原理，删除了YarrowialipolyticaACA-DC50109菌株中与碳源阻遏相关的MIG1基因，得到敲除菌株M25；敲除菌株M25与原始菌株相比，细胞的油脂含量由36.0%提高到48.7%，敲除菌株M25的细胞比原始菌株的细胞有更多的油滴；利用RT-PCR分析了敲除菌株M25中21个油脂代谢相关基因转录水平的变化。大部分与脂肪酸合成和三酰甘油合成有关的基因的转录水平大大提高，仅有与脂肪酸β-氧化关联的MFE1基因的转录水平下降为原始菌株的31.2%，这可能是敲除菌株M25油脂含量提高的原因。筛选自红树林的2F5菌株能够利用菊粉高效累积油脂，该菌株鉴定为圆红冬孢酵母（Rhodosporidiumtoruloides）；设计简并引物，PCR扩增得到2F5菌株中编码菊粉酶基因的片段；分其编码的氨基酸序列具有菊粉酶的典型保守区位点；菊粉浓度为60g/l时，2F5菌株含油量最大，达到62.14%，生物量为15.82g/l。在2-l发酵罐培养96h，油脂含量达到最大值70.36%，生物量为16.64g/l；2F5菌株所累积的油脂中十六碳和十八碳脂肪酸占到绝大部分；由2F5菌株生产的油脂制备的生物柴油燃烧性能良好。筛选得到一株能同时生产胞内油脂和胞外油脂的酵母菌p1721，鉴定为沼泽红酵母（Rhodosporidium.paludigenum）。在10-l发酵罐中培养108h，胞外油脂达到最大产量17.0g/l，同时生物量为19.2g/l，胞内油脂为12.1g/l，细胞含油量达到63.2%(w/w)。利用气相色谱和气质联用分析了胞外油脂和胞内油脂的脂肪酸成分：胞外油脂主要成分为3-羟基十八烷酸、3-羟基十六烷酸；胞内油脂的主要成分为常规的十六碳和十八碳脂肪酸。通过简并引物PCR无法扩增得到编码PKS的基因，说明p1721菌株中不存在PKS途径；产油培养基中加入不同的脂肪酸代谢抑剂，影响了胞外油脂的产量和3-羟基脂肪酸所占的比例。根据上述结果推断3-羟基烷酸的合成首先是由脂肪酸氧化中三个酶作用形成3-羟基脂酰辅酶A，然后经由硫酯酶水解辅酶A形成。利用液质联用分析了胞外油脂的醇类成分，其中可能存在木糖醇、山梨醇和甘露醇。这些研究为进一步开发利用酵母菌油脂打下坚实的理论基础，特别是酵母菌分泌胞外油脂的研究为微生物油脂的生产提供了一个新思路。
【作者】王致鹏；
【导师】池振明；
【作者基本信息】中国海洋大学，微生物学，2014，博士
【关键词】微生物油脂；Mig1；菊粉；胞外油脂；

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