牙鲆（Paralichthys olivaceus）胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）基因的克隆和表达调控分析

【摘要】在鱼类和其它脊椎动物中，胰岛素样生长因子（IGF）信号系统对于机体的生长、代谢和繁殖有着非常重要的作用。该信号系统由两个配体（IGF-I，IGF-II）、两个受体（IGF-IR、IGF-IIR）和六个IGF结合蛋白（IGFBP1-6）组成。其中，IGFBPs不仅有依赖IGFs的作用，如调控IGFs的生物利用率、刺激或抑制IGFs的生物活性，还有不依赖IGFs的独立作用，可以通过结合细胞表面受体或直接进入细胞核调控细胞的生长和分化。在本研究中，我们首先从健康牙鲆肝脏组织中克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因序列并进行分析；利用荧光定量PCR技术分析了牙鲆四种IGFBPs基因的在成体组织中的分布和在不同发育时期的胚胎和仔鱼中的表达差异；利用原代培养的牙鲆肝脏组织细胞研究了不同激素对牙鲆IGFBP-3和IGFBP-4基因的表达调控作用；最后克隆得到牙鲆四种IGFBPs基因的启动子序列并进行了生物信息学分析。本研究的主要结果如下：（1）本研究克隆得到了牙鲆两个IGFBP-2基因。其中IGFBP-2a基因cDNA长1186bp，由42bp长的5’UTR、861bp长的ORF和283bp长的3’UTR组成，编码286个氨基酸前体，含有一个预测的26个氨基酸残基组成的信号肽。而牙鲆IGFBP-2b基因cDNA长1075bp，5’UTR、ORF和3’UTR的长度分别为47bp、819bp和209bp。编码248个氨基酸前体，含有一个预测的24个氨基酸残基组成的信号肽。这两个IGFBP-2蛋白均含有18个保守的半胱氨酸残基、2个保守的IGFBPs基序（GCGCCXXC和CWCV）、Arg-Gly-Asp（RGD）基序和肝素结合结构域（HBD）。系统进化分析结果显示牙鲆的IGFBP-2a和-2b基因位于IGFBP-2的不同分支，说明它们起源于同一祖先基因并经历了鱼类基因组的复制，是人类和其它哺乳动物IGFBP-2的同源基因。qPCR显示牙鲆IGFBP-2a和-2b基因在肝脏中表达量最高，但在其它外周组织中的表达存在差异。在早期胚胎发育过程中，IGFBP-2a的表达量明显高于IGFBP-2b，而在孵化后IGFBP-2b表达量开始逐渐上升，并超过IGFBP-2a。这说明IGFBP-2a主要参与了早期的胚胎发育，而IGFBP-2b在仔鱼的生长发育中发挥着重要作用。（2）牙鲆IGFBP-3基因的cDNA全长为1060bp，ORF为861bp，含有一个102bp长的5’UTR和一个97bp长的3’UTR。ORF编码286个氨基酸残基，并包含一个22个氨基酸残基的预测信号肽。牙鲆IGFBP-3蛋白含有18个半胱氨酸残基和2个典型的IGFBPs基序（GCGCCXXC和CWCV）。同时，该蛋白还存在核定位序列（NLS）、肝素结合结构域（HBD）和金属结合结构域（MBD）。牙鲆IGFBP-3基因全长15223bp，包括4个外显子和3个内含子。多序列比对和系统进化分析都表明牙鲆的IGFBP-3基因是鱼类IGFBP-3家族成员。qPCR结果显示牙鲆IGFBP-3在所有成体组织中都能被检测到，在精巢和卵巢中最丰富。此外，在牙鲆胚胎发育过程中均存在IGFBP-3的表达，且在孵化后7d的仔鱼中表达量相对较低，而在变态期间显著上升。这表明牙鲆IGFBP-3通过调控IGFs活性对鱼类早期的生长和发育有非常重要的作用。（3）牙鲆IGFBP-4基因cDNA序列全长为1493bp，包含一个552bp长的5’UTR和一个161bp长的3’UTR。其完整的ORF长780bp，预测编码259个氨基酸残基的前体，含28个氨基酸残基组成的信号肽。在牙鲆IGFBP-4蛋白的N-和C-端结构域中含有20个保守的半胱氨酸残基和2个典型的IGFBPs基序（GCGCCXXC和CWCV）。牙鲆IGFBP-4基因全长13414bp，包括4个外显子和3个内含子。序列比对和系统进化分析都表明牙鲆的IGFBP-4基因是哺乳动物IGFBP-4基因的同源基因。qPCR结果显示牙鲆IGFBP-4在成体各组织中均有分布，在肠中表达量最高。在早期胚胎和仔鱼发育过程中，牙鲆IGFBP-4均有不同程度的表达。在孵化后3d和15d的仔鱼中表达量增高，而在变态期逐渐降低。这表明IGFBP-4参与了牙鲆的生长发育过程，并受到营养状况的调控。此外，利用pET-32a（+）原核表达载体构建了含牙鲆IGFBP-4成熟肽的重组质粒。使用BL21（DE3）pLysS感受态细胞成功表达了牙鲆IGFBP-4成熟肽蛋白，其以可溶性蛋白形式存在，最佳培养条件为20℃连续培养6h。（4）在体外原代培养的牙鲆肝脏组织细胞中，10nM和100nM浓度的GH均能显著增加牙鲆IGFBP-4的表达。当用10nM的GH处理肝细胞时，在处理6h后IGFBP-4的表达量就开始上升并随着处理时间的延续维持相对较高水平。不同浓度的胰岛素可以降低原代培养的牙鲆肝细胞中的IGFBP-4的表达量。当培养基中的胰岛素浓度为10μM，在处理6～48h后均引起IGFBP-4表达量的持续下降。不同浓度的IGF-I和IGF-II对肝细胞中IGFBP-4表达量的影响呈现连续波动趋势。而10ng/μl的IGF-I可以使IGFBP-4的表达量显著下降。另外，不同浓度的GH和胰岛素以及高浓度的IGF-I和IGF-II都会增加原代培养的牙鲆肝细胞中IGFBP-3的表达量。在时间效应实验中，10nM的GH使IGFBP-3的表达量在处理后48h达到最大值；而10μM的胰岛素和100ng/μl的IGF-I使IGFBP-3的表达量先增加后降低。（5）利用染色体步移的方法克隆得到了牙鲆IGFBP-2a、-2b、-3和-4基因的启动子序列，分别长为2145bp、1638bp、1811bp和2753bp。利用不同的在线网站分析预测了各启动子区存在的潜在顺式作用元件和转录因子结合位点。结果发现在牙鲆IGFBP-3和-4转录起始位点上游-30bp处，均含有一个典型的TATAbox，而在IGFBP-2a和-2b基因中没有发现TATAbox的存在。在四种牙鲆IGFBPs的启动子区中均发现C/EBP、CREB、GATA、HNF、Pit-1、Oct-1、RXR、GR、PR、SRY等转录因子结合位点。而在IGFBP-4启动子中存在ER结合位点，在IGFBP-3中启动子中存在Sox-5结合位点。另外，在IGFBP-4和IGFBP-2s启动子中存在AhR结合位点，而在IGFBP-3启动子中没有。这些结果都表明不同转录因子对牙鲆IGFBPs的调控作用存在差异，牙鲆IGFBPs基因的表达也受到不同调控机制的作用，并发挥不同的生物学功能。
【作者】王晶；
【导师】张全启；
【作者基本信息】中国海洋大学，遗传学，2014，博士
【关键词】牙鲆；胰岛素样生长因子结合蛋白；cDNA克隆；表达调控；启动子分析；

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