假单胞菌降解尼古丁的分子机制研究

【摘要】尼古丁是一种天然的生物碱,进入人体后能对多种组织如心、脑、肺和血管等造成损伤,容易引发肺癌在内的多种疾病。我国是烟草生产和消费的大国,烟草加工过程中所产生的废弃物中含有较高浓度的尼古丁,给环境带来极大威胁。微生物处理该类型的污染是一种高效、可靠和无二次污染的绿色处理方式。因此,筛选高效降解尼古丁的微生物菌种资源,探索其降解机制机理,充分发挥其降解能力,具有重要的理论意义和应用价值。本研究的意义在于分离、筛选高效尼古丁降解菌株,并对菌株在不同环境条件下降解尼古丁的特性进行研究,测定降解途径,克隆关键降解酶基因,从生物化学和分子生物学角度揭示Pseudomonassp.HZN6降解尼古丁的新机制,为尼古丁引起的环境污染的微生物降解修复及绿色转化提供理论和技术依据。本研究从从杭州农药厂的活性污泥中分离到1株尼古丁高效降解菌株HNZ6,可以利用尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长。根据生理生化特征以及16SrRNA(GenBank登录号为HQ108345)系统发育分析,确定菌株HZN6为假单胞菌属(Pseudomonas)细菌。研究了不同条件对HZN6降解尼古丁的影响,结果显示降解尼古丁的最适温度为30℃,最适pH值为7.0,在12h内完全降解500mg/L尼古丁,为该菌在处理尼古丁污染的消去及应用提供理论基础。通过紫外扫描法、HPLC、LC/MS和GC/MS等检测方法,检测到3个主要的中间产物,分别为假氧尼古丁(Pseudooxynicotine,PN)、3-琥珀酰-吡啶(3-Succinoyl-Pyridine,SP)和6-羟基3-琥珀酰-吡啶(6-Hydroxy-3-Succinoyl-Pyridine,HSP),初步推测菌株HZN6降解尼古丁的途径为吡咯烷途径。通过pSC123转座子诱变和影印平板法构建了尼古丁降解失活的突变株文库,筛选到229株突变株。其中Ⅰ型突变株84株,即不能利用尼古丁为唯一碳源生长,也不能降解尼古丁,占总数的37%。Ⅱ型突变株66株,即不能利用尼古丁为唯一碳源生长,但能降解尼古丁至某一中间产物,占总数的29%。Ⅲ型突变株79株,即不能利用尼古丁为唯一碳源生长,但能完全降解尼古丁,占总数的34%。突变株N6m1为Ⅱ型突变,UV和HPLC结果显示该菌降解途径终止于SP。利用SEFA-PCR的方法扩增得到4583bp的片段(GenBank登录号为HQ832741)。其中的orfC被插入突变。该基因编码一种硫转移酶同源蛋白SirA2。通过orfC基因的敲除与功能互补,确认其突变导致SP不能降解。除了利用HZN6中orfC基因互补之外,来自KT2440的pp1233基因也能达到互补的功能并发现假单胞菌属中的orfC(sirA2)基因及orfABCD基因簇在已知的假单胞菌中高度保守。HNZ6在含钨酸盐的MSM中降解结果显示不能降解次黄嘌呤,但能降解SP,故HZN6中SP的羟化酶不属于黄嘌呤脱氢酶型。orfC(sirA2)基因的敲除不仅导致SP降解能力失活,而且HX也不能降解,表明该基因也与HX的羟化相关。突变株N6mC8为为Ⅱ型突变,降解PN能力缺失。利用SEFA-PCR的方法扩增到3874bp的片段(GenBank登录号为JN391188),包含pao和sap两个基因,大小分别为1494bp和1434bp。其中pao基因被pSCl23转座子突变失活。经同源性比较发现pao基因编码假氧尼古丁胺氧化酶(PNAO),与含核黄素的胺氧化酶同源性最高(30%左右)。sap基因编码3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶(SAPD),与醛脱氢酶蛋白同源性最高(40%左右)。分别负责尼古丁降解过程的第二、第三步。将pao和sap基因克隆至表达载体pET29a(+),转化E.coliBL21(DE3),确定最佳诱导条件为0.2mMIPTG、20℃诱导20-24h。诱导的蛋白经超声破碎、Ni-NTA亲和层析柱纯化后,重组的PNAO呈黄色,HPLC和UV方法测定其辅酶为非共价连接的FAD。且每单体酶分子含有0.5分子FAD。测定了NAO的反应过程。通过HPLC和LC/MS检测到产物SAP。利用层析和PFB衍生化的方法鉴定了产物甲胺。利用过氧化氢定量检测试剂盒(水溶性)检测到H2O2。在无氧条件下的反应体系几乎没有H202生成,即反应需要氧的参与。底物PN与产物甲胺、H202的摩尔比为1：1：1。建立了PNAO的反应体系：在50mMPBS(pH8.0),1mMPN,10mg/L纯酶PNAO,35℃反应10min。反应动力学常数Km和Kcat值分别为0.247±0.019mM和151土14s-1,催化效率(kcat/Km)值为611mM-1·s-1。Ag+,Co2+,Cu2+和Hg2+强烈抑制酶活性,Ca2+,Mg2+,Mn2+,Ni2+,和Zn2+对酶活性无显著影响。此外,PNAO具有底物特异性。利用PNAO和SAPD双酶偶联法测定了SAPD活性,即催化SAP脱氢生成SP和NADPH。NAD+不能作为该反应的辅酶。在偶联反应中,出发底物PN与产物SP和NADPH的比值约为1：1：1。SAPD无底物特异性,对甲醛和乙醛等均有活性。利用同源重组将pao和sap基因分别敲除。降解能力测定显示pao基因为降解必需,而sap基因不影响尼古丁代谢,只是降解较野生菌慢。但经以PN为唯一碳源生长多次传代之后,其降解特性达到野生菌的水平。利用SEFA-PCR的方法克隆pao基因5’上游3640bp的序列(GenBank登录号为JN391188),包含3个基因,其中nox基因大小为1437bp,编码一种含核黄素的胺氧化酶蛋白,将其克隆至广宿主载体并转化至KT2440,重组菌获得尼古丁降解活性。通过同源重组的方法将nox基因敲除,敲除后的重组子失去尼古丁降解能力,而nox基因回补后又恢复了降解性能。证明该基因编码尼古丁氧化酶(NOX),催化尼古丁降解的第一步,即由尼古丁生成PN,且对(S)-和(R)-尼古丁的降解速率相同,即不具有对映体选择性降解。通过提取降解过程中总RNA并利用RT-PCR的方法证明nox基因在HZN6中为尼古丁诱导型。同时nox基因在大肠杆菌DH5a存在表达,但是重组子无尼古丁降解能力。将nox基因克隆至表达载体pET29a(+)并转化E.coliBL21(DE3),通过诱导、破碎和纯化,得到的蛋白无活性。推测NOX可能需要某种假单胞菌中特有的附加因子的参与。对NOX的催化机制进行了初步研究。采用I-TASSER软件预测了NOX的三维结构,采用MVD软件将NOX和尼古丁进行分子对接。(R)-和(S)-型尼古丁均与His456形成氢键,两个对映体形成镜像结构。利用定点突变的方法证明His456以及FAD结合序列GXGXXG为NOX降解活性所必需。
【作者】邱吉国；
【导师】刘维屏；
【作者基本信息】浙江大学，环境科学，2014，博士
【关键词】尼古丁；生物降解；Pseudomonassp.HZN6；代谢途径；降解基因；

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