β肾上腺素受体信号对佐剂性关节炎大鼠树突细胞及成纤维样滑膜细胞的影响

【摘要】肾上腺素受体（AR）作为神经免疫调节的关键受体，可能参与了类风湿关节炎（RA）的发生、发展过程。树突细胞（DCs）作为功能强大的抗原提呈细胞，在调节免疫应答反应中起重要作用，可能在以下几个方面参与RA的发病机制：DCs能激活淋巴器官中MHC限制性自身免疫反应，诱导免疫应答；DCs浸润至滑膜和滑液中，关节局部内摄取、处理、提呈抗原，促使RA迁延持续；DCs、滑膜细胞、巨噬细胞一起产生炎性介质，进一步刺激产生RA的炎症免疫反应等。成纤维样滑膜细胞（FLS）是类风湿关节炎的主要效应细胞，其异常增殖，同时自身分泌的IL-1β、TNF-α和RANKL等炎性细胞因子加剧了局部的炎症反应。DCs和FLS均有AR的表达，均可能参与对RA的神经免疫调节，尤其是β-AR信号可能具有炎症免疫调节的作用。本课题采用佐剂性关节炎（AA）大鼠模型，运用流式细胞术、QRT-PCR、免疫荧光、免疫印迹等方法，通过观察β-AR激动药（ISO）对DCs和FLS功能的影响，探讨β-AR及其信号对DCs和FLS功能的调节作用，进一步研究该信号通路在AA大鼠DCs和FLS中的异常变化及部分机制，为揭示β-AR信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制提供实验依据。目的：观察β-AR信号对大鼠DCs和FLS功能的调节作用，探讨AA大鼠DCs和FLS上β-AR信号的变化及对其功能的影响，为揭示β-AR信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制以及药物作用新靶点提供重要依据。方法：采用rIL-4、rGM-CSF刺激大鼠骨髓源细胞，诱导生成DCs；流式细胞术检测DCs表型CD80、CD86、MHC-Ⅱ的表达和抗原摄取功能，FLS表面β2-AR的表达采用FITC标记的二抗间标法检测，均以平均荧光强度表示表达的高低；MTT法检测FLS的增殖及混合淋巴细胞反应（MLR）中T细胞的增殖；ELISA法检测IL-1β、IL-10、TNF-α、RANKL、OPG和cAMP的水平；采用完全弗氏佐剂于大鼠足趾注射制得AA模型，β2-AR激动药灌胃给予，使用足爪仪测足爪容积计算足爪肿胀度，HE染色观察关节病理，胸腺、脾脏重量与体重的比值表示胸腺、脾脏指数；免疫组化法检测β2-AR在DCs和FLS上的分布；免疫荧光法检测β2-AR在FLS上的表达情况；Westernblot法检测β2-AR、GRK2、β-arrestin2的膜表达和p-ERK的表达；QRT-PCR法检测β2-ARmRNA、GRK2mRNA的表达。结果：1.β-AR信号对AA大鼠DCs功能的影响β-AR激动药ISO能明显下调CD86、MHC-Ⅱ的表达，对CD80表达无明显影响；ISO能明显提高DCs的抗原摄取功能，升高IL-10的水平，抑制MLR。ISO主要通过β1-AR信号下调CD86的表达，通过β2-AR信号影响MHC-Ⅱ的表达、影响抗原的摄取功能、产生对MLR的影响。β2-AR激动药沙丁胺醇体内给药能显著下调AA大鼠肠系膜淋巴结DCs和骨髓源DCs表面MHC-II的表达，提高DCs的吞噬能力，但对CD80、CD86的表达无明显影响，与体外实验结果一致；β2-AR激动药沙丁胺醇能明显降低AA大鼠足爪肿胀度，不同程度的改善关节的异常病理；能显著降低AA大鼠的胸腺、脾脏指数，抑制T淋巴细胞，但对B淋巴细胞增殖反应无明显影响。ISO处理后的AA模型组骨髓源DCs对T细胞增殖的抑制作用明显低于正常组，Westernblot法检测AA模型组大鼠骨髓源DCs胞膜中β2-AR表达明显下降。AA病程中研究发现，致炎后d21、d28，β2-AR的膜表达显著降低，GRK2的膜表达显著升高；基因水平显示，β2-ARmRNA、GRK2mRNA无显著变化。2.β-AR信号对AA大鼠FLS功能的影响ISO能明显抑制FLS的增殖，抑制FLS分泌IL-1β、TNF-α和RANKL的水平，促进OPG的分泌水平，其抑制增殖作用主要通过β2-AR信号发挥。β2-AR激动药沙丁胺醇体内给药能抑制FLS的增殖反应。β2-AR在AA大鼠FLS胞膜的表达显著下降，ISO对其增殖的抑制作用明显降低，刺激后β2-AR的脱敏作用明显高于正常对照组。AA大鼠FLS胞膜中GRK2、β-arrestin2的表达显著升高。AA模型组cAMP水平明显降低，经ISO刺激后对照组和AA模型组cAMP水平均显著升高，但AA模型组cAMP水平显著低于对照组。AA模型组p-ERK水平显著增高，经ISO刺激，AA模型组p-ERK水平显著高于对照组；与未刺激组相比，ISO能显著升高AA模型组FLSp-ERK的水平，对对照组无明显影响。结论：1.β2-AR信号参与了对DCs和FLS功能的调节。（1）β2-AR信号促进DCs的抗原摄取，抑制其抗原的提呈功能。（2）β2-AR信号的激活可以抑制FLS增殖。2.β2-AR信号在AA大鼠DCs和FLS中的异常改变是其对激动药反应存在差异的原因。（1）AA大鼠DCs和FLS中β2-AR膜表达下降是其对激动药反应减弱的重要原因。（2）AA大鼠GRK2、β-arrestin2转膜的增加，导致β2-AR脱敏的增强，可能是β2-AR膜表达下降主要原因。（3）β-arrestin2转膜的增加，导致p-ERK表达的增高，也可能是AA大鼠FLS对β-AR激动药反应减弱的原因。
【作者】吴华勋；
【导师】魏伟；
【作者基本信息】安徽医科大学，药理学，2014，博士
【关键词】佐剂性关节炎；肾上腺素受体；树突细胞；成纤维样滑膜细胞；脱敏；p-ERK；

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