IL-35诱导急性髓细胞白血病细胞免疫逃逸的作用及机制

【摘要】急性髓细胞白血病(AcuteMyeloidLeukemia,AML)是最常见的成人血液系统恶性肿瘤,其发病机制复杂,基因突变、遗传物质异常以及免疫功能缺陷等因素均是造成AML完全发病的重要因素。CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+RegulatoryTCells,Tregs)是一群具有免疫抑制作用的特殊细胞亚群,其既可以通过细胞-细胞接触方式直接杀伤效应性免疫细胞,又可以通过分泌IL-10和TGF-β等细胞因子以非细胞接触方式抑制免疫应答,从而在诱导和维持机体的免疫耐受过程中发挥重要作用。我们前期工作基础和其他学者多项研究均表明,初诊AML患者外周血和骨髓中Tregs比例均显著高于健康对照组,其不仅显著抑制CD4+CD25-效应性T细胞(CD4+CD25-EffectorTCells,Teffs)的增殖和分泌细胞因子,还显著抑制过继性输入的肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CytotoxicTLymphocyte,CTLs)的增殖和扩散,故Tregs被认为是诱导AML细胞逃逸机体抗肿瘤免疫应答的关键因素,为AML患者提供了一个潜在的治疗靶点。然而,最新研究表明单纯利用抗CD25单克隆抗体或者白喉毒素/IL-2融合蛋白等方法去除Tregs,还是只能给AML荷瘤小鼠带来短暂性疗效,因为肿瘤微环境能够很快再次诱导Tregs的表达；同时,利用中和性抗体的方法中和掉IL-10或TGF-β的活性,也并不能完全阻断Tregs的免疫抑制作用,这提示Tregs的体内表达调控网络非常复杂,而且除了经典的抑制性细胞因子IL-10和TGF-β,或许还有其他细胞因子介导了它的免疫调节作用,这给以其为靶点的AML治疗带来了实际困难。IL-35是一种近年发现的的新型细胞因子,其属于IL-12细胞因子家族,由IL-12a亚基p35和IL-27p亚基EB病毒诱导的基因3(Epstein-BarrVirusInducedGene3,EBI3)以异二聚体形式组成。在细胞来源方面,目前研究表明小鼠IL-35可能特异性来源于Tregs,但人’Tregs是否产生IL-35目前尚存在争议,且基因组学研究提示除Tregs之外,IL-35可能有着更为广泛的细胞来源；在生物学功能方面,IL-35被认为具有强大的免疫抑制作用,其不仅能直接抑制Teffs的分化、增殖和分泌细胞因子,又能招募髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-DerivedSuppressorCells,MDSCs)聚集并促进血管生成,还能促进Tregs的增殖并为其发挥最大免疫抑制功能所必需,甚至还能诱导产生一种Tregs新亚群”iTr35″(IL-35InducedRegulatoryTCells,iTr35),从而级联放大Tregs的免疫调节作用。综上所述,IL-35作为IL-12细胞因子家族的一个新成员,其无论是来源方面还是功能方面,均与Tregs密切相关。因此,我们认为IL-35的发现正好为阐明Tregs在AML中的表达调控及作用机制带来了良好的契机,本文即以此为出发点来展开研究,以期进步揭示AML细胞的免疫逃逸机制,并同时探讨通过干预IL-35的表达而提高免疫细胞杀伤AML细胞能力的方法,以期为AML免疫治疗提供实验基础和新思路。本研究共收集了28例初诊成人AML患者及其在首次获得完全缓解(27例)和首次复发(7例)时的外周血标本,同时选择了30例年龄匹配的健康成年人外周血标本作为对照,然后对IL-35在AML中的表达、来源、诱导AML细胞免疫逃逸的作用和机制,以及干预IL-35的表达对免疫细胞杀伤AML细胞活性的影响进行了分析。具体实验方法和实验结果如下：(1)我们通过对常见免疫细胞及其相关细胞因子的检测,发现AML患者外周循环中NKT、B、CD8+T、总CD4+T、Th1、Th17、IL-15、sCD25、IL-2、IFN-γ以及IL-17等效应性免疫细胞和炎症因子明显低于健康对照组,而Th2、Tregs、IL-4、IL-10以及TGF-β等调节性免疫细胞和抗炎因子明显高于健康对照组,这提示AML患者处于明显的免疫功能紊乱状态,有利于AML细胞逃逸机体的抗肿瘤免疫应答反应而得到恶性生长和增殖。(2)我们通过多种实验方法对IL-35蛋白和mRNA的分析,发现初诊AML患者的IL-35表达水平与健康对照组相比显著升高,且在获得完全缓解后降低,而复发时再度升高,这提示AML患者体内存在IL-35的高表达且与其疾病发生发展密切相关,可能是介导AML细胞免疫逃逸的重要因素。(3)我们分离纯化了部分初诊AML患者的Tregs、Teffs以及AML细胞,并将其进行了短期的体外培养和刺激,然后在静息和活化状态下对它们是否表达IL-35做了检测,结果发现Tregs在静息状态下不表达IL-35但经活化后显著表达,同时部分患者来源的AML细胞亦表达IL-35,但Teffs无论是静息还是活化状态下均不表达IL-35；另外,我们还检测了AML患者体内iTr35的表达水平,发现其显著高于健康对照组且在静息和活化状态下均表达IL-35；这提示AML中Tregs、iTr35和AML细胞均是IL-35表达的细胞来源之一。(4)我们通过Teffs、Tregs和iTr35体外刺激实验或细胞共培养实验,发现IL-35显著抑制Teffs的增殖及其杀伤AML细胞的活性,同时又显著促进Tregs和iTr35的扩增,并且这种IL-35扩增的Tregs和iTr35对Teffs的增殖具有显著抑制作用,这提示IL-35不仅能直接抑制Teffs的免疫应答,还能促进Tregs和iTr35的表达和功能,从而介导了AML细胞免疫逃逸。(5)我们通过对IL-35刺激的AML细胞增殖和凋亡情况进行分析,发现IL-35显著上调AML细胞中IL-35R的表达,同时与PBS对照组相比IL-35还显著促进AML细胞的增殖,而且发现用IL-35预刺激的AML细胞能显著抵抗VP-16诱导的凋亡,这提示IL-35可以通过结合其受体直接作用于AML细胞,并显著促进AML细胞的增殖和抑制AML细胞的凋亡。(6)细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-InducedKillerCells,CIK)是AML过继性细胞免疫治疗的首选方案,然而其疗效有待进一步提高。本研究中我们通过免疫表型分析和细胞因子检测,发现体外扩增的CIK细胞中包含有大量的Tregs及其分泌的IL-35,严重影响了其最大免疫杀伤活性；故我们在实验中对体外制备CIK细胞的培养方案进行了优化,即将方案中的淋巴细胞活化因子由IL-2更换成了IL-15,结果发现与传统IL-2扩增的CIK细胞相比,IL-15扩增的CIK细胞中Tregs和IL-35的表达显著下调,但对AML细胞的杀伤活性却显著增强,这提示干预Tregs和IL-35的表达能显著提高CIK细胞杀伤AML细胞能力。(7)将树突状细胞(DendriticCells,DCs)与CIK细胞联合培养(即DC-CIK细胞)是近年进一步活化CIK细胞的有效方法,其可以通过抗原提呈途径显著增强CIK细胞的抗肿瘤能力,然而通过DC-CIK细胞与CIK细胞的生物特性及其对AML细胞抗肿瘤活性的比较分析,我们发现与CIK细胞相比,DC-CIK细胞中Tregs和IL-35的表达显著下调,但对AML细胞的杀伤活性却显著增强,这提示通过下调Tregs和IL-35的表达也是DCs提高CIK细胞对AML细胞杀伤活性的重要途径之一。总之,本研究发现,AML患者体内存在严重的免疫功能紊乱,其中,近年发现的新型细胞因子IL-35表达水平显著升高且与疾病发生发展密切相关；这些IL-35既可以来源于Tregs和iTr35,又可以来源于部分AML细胞；IL-35可以通过抑制Teffs和促进Tregs和iTr35的表达和功能以及直接促进AML细胞的增殖和抑制AML细胞的凋亡来诱导AML细胞的免疫逃逸；同时,Tregs及其分泌的IL-35还是影响C1K细胞杀伤AML细胞活性的重要因素,而通过利用IL-15替代IL-2制备的CIK细胞或将CIK细胞与DCs共培养,可以通过下调Tregs和IL-35的表达而显著提高其杀伤AML细胞的能力。因此,我们认为IL-35在AML细胞免疫逃逸过程中发挥了重要作用,或许有望成为今后AML患者免疫治疗的新靶点。
【作者】陶千山；
【导师】翟志敏；
【作者基本信息】安徽医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】急性髓细胞白血病；免疫逃逸；白介素-35调节性T细胞；iTr35细胞；

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