激活转录因子3促进皮肤癌细胞增殖机制初探

【摘要】背景：皮肤癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，可笼统分为恶性黑色素瘤和非黑色素瘤性皮肤癌，后者主要包括鳞状细胞癌和基底细胞癌。皮肤癌严重者可危及生命，其发病率逐年上升，已经成为了一个全球性的公共健康问题。多种危险因素可导致皮肤癌的发生，包括内源性因素（遗传因素、基因突变等）和外源性因素（如紫外线暴露，化学致癌物质和其他环境压力）。早期诊断和治疗，可以减少因该病所造成的死亡和畸型。然而，皮肤癌发生的确切分子机制仍不清楚，这严重的影响了对于该病的治疗和预防。激活转录因子3（ATF3）是ATF/CREB转录因子家族成员之一，特征性的含有碱性亮氨酸拉链（bZIP）基序。正常细胞中ATF3的表达处于较低水平，但可由多种不同的胞外信号诱导而迅速上调表达，包括生长因子，细胞因子和某些基因毒性应激剂。做为转录因子，ATF3广泛参与人体的多种生理功能，包括维持身体内环境平衡，伤口愈合，细胞粘附，肿瘤细胞侵袭，细胞凋亡和信号通路等。新的证据表明，ATF3可能通过调整增殖和凋亡信号之间的微妙平衡关系，影响肿瘤的发生和发展。值得思考的是，ATF3在肿瘤发展中发挥的作用不尽相同，这可能取决于细胞的类型和所处的环境背景。有报道提示，免疫抑制宿主ATF3高表达可抑制p53依赖的细胞衰老，从而增加了皮肤鳞状细胞癌发生的可能性，但在皮肤癌背景下，ATF3与p53两者之间的相互作用关系，以及ATF3促进皮肤癌发生的分子机制仍不明确。信号传导蛋白和转录激活物3（Stat3）是生长因子受体（GFR）下游的信号转导蛋白，调节着参与细胞周期进程，细胞凋亡，血管生成，肿瘤细胞侵袭和转移相关靶基因的表达，其在肿瘤发生过程中发挥着重要的调控作用。有研究显示，Stat3在许多上皮癌，包括头和颈、乳腺、肺、皮肤、前列腺癌中存在组成型激活；表皮特异性Stat3缺陷小鼠皮肤癌发生相关实验结果表明，Stat3在上皮癌启动和促进阶段均发挥着重要作用。然而在ATF3促进皮肤癌发生的过程中，Stat3的角色作用尚不清楚。表遗传学相关改变是肿瘤发生的另一重要机制，这其中就包括组蛋白乙酰化模式的失调。能够阻断组蛋白脱乙酰酶（HDAC）活性的组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）已被研发并用于多种肿瘤的靶向治疗。HDACi如曲古抑菌素A（TSA）和丁酸盐，可改变正常的染色质结构，从而导致相关基因表达和调控的改变。已有报道，TSA可引起肿瘤细胞的生长抑制并增加癌细胞的凋亡敏感性，同时有报道显示，ATF3可能与HDACs发生物理性的相互作用，通过对乙酰化修饰作用的调节，影响靶基因的表达，但ATF3在TSA诱导的肿瘤细胞生长抑制过程中的角色作用，特别是ATF3与TSA重要靶基因p21之间的相互作用关系，仍不明确。目的：在本实验中，我们拟利用qPCR技术和WB等技术分析ATF3在皮肤癌组织和皮肤癌细胞株中的表达情况，同时联合MTT法分析ATF3表达状态对细胞增殖活性的影响，从而进一步明确ATF3与皮肤癌发生之间的关系；基于SCC-13细胞和p53缺失的RTS3b细胞，利用细胞转染和荧光素酶报告基因检测等技术明确ATF3、p53和Stat3之间的相互作用关系，阐明ATF3对p53-Stat3级联信号的影响；从表遗传学角度，分析ATF3在TSA造成的表皮样癌细胞生长抑制过程中所发挥的作用，以及ATF3与TSA重要靶基因p21之间的相互作用关系。从而初步阐明ATF3促进皮肤癌细胞增殖的可能分子机制。方法：1、皮肤癌组织ATF3的表达，皮肤癌组织来源原代培养细胞、SCC-13细胞，和p53缺失的RTS3b细胞ATF3的转录表达及蛋白水平测定：临床来源的皮肤癌组织和正常皮肤组织各30例，利用qPCR技术，比较分析上述组织的ATF3转录表达水平，选取ATF3高表达的皮肤癌组织和ATF3低表达的正常皮肤组织各3例，建立原代培养细胞系，利用qPCR技术和WB技术分析皮肤癌组织来源细胞、正常组织来源细胞、SCC-13细胞，和p53缺失的RTS3b细胞ATF3的转录表达情况和蛋白表达水平。2、利用MTT法比较分析皮肤癌组织来源和正常皮肤组织来源的原代培养细胞、SCC-13细胞和P53缺失的RTS3b细胞的增殖活性。3、利用荧光素酶报告基因检测技术分析ATF3过表达对SCC-13细胞和P53缺失的RTS3b细胞Stat3转录活性的影响。4、利用细胞转染技术，分别使用ATF3shRNA质粒，pcDNA3载体，pcDNA3-p53，pcDNA3-Stat3C和/或pcDNA3-ATF3质粒转染SCC-13和P53缺失的RTS3b细胞，并联合使用Stat3抑制剂Stattic，后续利用MTT法对转染细胞的增殖活性变化情况进行比较分析，利用WB技术分析ATF3过表达对Stat3和p53蛋白水平的影响。5、利用细胞培养联合细胞转染、qPCR和WB等技术，分析ATF3在TSA造成的表皮样癌细胞生长抑制过程中所发挥的作用，以及ATF3与TSA重要靶基因p21之间的相互作用关系。结果：1、qPCR检测结果提示：与正常皮肤组织相比，皮肤癌组织中ATF3表达上调，而正常皮肤组织中ATF3表达处于较低水平。WB检测结果显示，ATF3高表达皮肤癌组织来源的原代培养细胞ATF3蛋白水平高于ATF3低表达的正常组织来源的原代培养细胞；蛋白表达水平与组间ATF3转录表达差异相一致。2、MTT法检测结果显示，皮肤癌组织来源的原代培养细胞增殖活性明显高于正常组织来源的原代培养细胞；利用细胞转染技术，敲低ATF3表达后，SCC-13细胞增殖活性明显降低，而ATF3增强表达则显著提高了该细胞的增殖活性。3、利用WB技术证实皮肤癌组织来源的原代培养细胞Stat3磷酸化水平明显高于正常皮肤组织来源的原代培养细胞。利用细胞转染技术证实ATF3过表达SCC-13细胞Stat3磷酸化水平明显高于ATF3敲低组，说明ATF3为Stat3活化所需要，ATF3过表达上调了Stat3磷酸化水平。荧光素酶报告基因检测实验结果提示ATF3正向调节Stat3的转录活性。实验同时发现，皮肤癌组织来源的ATF3高表达的原代培养细胞p53表达水平较低，ATF3敲低表达使SCC-13细胞p53表达上调，而ATF3过表达明显抑制了该细胞株p53的表达水平。4、P53缺失的RTS3b细胞Stat3磷酸化水平高于SCC-13细胞，利用细胞转染技术证实，ATF3过表达对P53缺失的RTS3b细胞的Stat3磷酸化水平和转录活性没有影响，提示ATF3可能通过下调p53的表达来阻遏后者对Stat3活性的抑制作用。5、组成型激活Stat3（Stat3C）显著促进了皮肤癌细胞生长，这与ATF3功能相一致。相反，Stat3抑制剂Stattic抑制了SCC-13细胞的增殖活性，提示ATF3对皮肤癌细胞的增殖促进作用被Stattic所阻遏，提示ATF3对皮肤癌细胞的增殖促进作用主要是通过调节Stat3的活性来实现的。此外，ATF3上调表达对SCC-13细胞增殖活性的促进作用可被p53过表达所抑制，而ATF3上调表达对P53缺失的RTS3b细胞的增殖活性无显著影响。提示，ATF3通过对p53-Stat3级联信号的调节实现了对皮肤癌细胞增殖的促进作用。6、我们还从表遗传学的角度对ATF3可能具有的促进癌细胞增殖的作用进行了初步研究，结果提示ATF3可能通过抑制p21基因表达干扰TSA引起的表皮样癌细胞的生长抑制。结论：在皮肤癌组织中存在ATF3上调表达，ATF3上调表达具有促进皮肤癌细胞增殖的作用。进一步的研究表明ATF3可抑制皮肤癌细胞P53的表达，进而削弱了p53对Stat3的抑制作用，致Stat3表达和活化水平上升，最终导致肿瘤细胞的增殖活性提高。ATF3通过调节p53-Stat3级联信号通路，实现了其对于肿瘤细胞的增殖促进作用，这可能是ATF3促进皮肤癌发生的主要机制之一。此外，ATF3促进肿瘤细胞增殖还可能存在着大量其他未知的机制，如在表遗传学方面，我们发现ATF3可能通过抑制p21基因表达干扰TSA引起的表皮样癌细胞生长抑制。上述结果有益于我们进一步认识皮肤癌发生的分子病理机制。ATF3过表达，增加了皮肤癌的发生风险，ATF3表达水平或可成为判断皮肤癌预后的指标，而ATF3-p53-Stat3级联信号通路可能成为预防皮肤癌发生和治疗该病的潜在靶点。
【作者】郝震锋；
【导师】杨蓉娅；
【作者基本信息】第三军医大学，皮肤病与性病学，2014，博士
【关键词】激活转录因子3；信号传导蛋白和转录激活物3；p53；p21；皮肤癌；

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