MicroRNA-497在肝细胞癌中的表达、预后及调控侵袭转移的机制研究

【摘要】肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,全球每年HCC死亡病例数达600,000,居全球癌症死因的第三位。虽然肝癌的根治性切除、肝移植、综合治疗已经明显改善了肝癌的预后,但肝癌的5年生存率仍长期徘徊于30%-40%。HCC的发生和发展是一多步骤的复杂过程,涉及到众多癌基因和抑癌基因的异常表达,阐明HCC发生发展过程中的分子机制,特别是转移相关的机制,对发展有效的防治策略尤为重要。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为17-25个核苷酸的非编码RNA。miRNAs作为转录后调控因子,可与靶基因的3’非读码区(3’uTR)特异性结合,诱导靶基因mRNAs的降解或抑制其翻译,调控靶基因的表达。迄今在人类基因组中证实的miRNAs已超过1000个。MiRNAs参与了生命过程中的一系列重要进程,包括肿瘤的发生、发展和转移。MiRNAs在HCC的发生发展中也具有重要作用,可调控HCC细胞的生长、凋亡、侵袭转移和DNA甲基化等众多病理进程。尽管近年来对于miRNAs调控肝癌发生发展的研究已经取得了较大的进展,但是绝大多数miRNAs在肝癌中的作用及其作用机制依然未知,迫切需要进一步研究。MiR-497属于miR-15家族中的一员,这个家族包括miR-15,miR-16,miR-195等。在人类肿瘤中,miR-15家族在许多肿瘤中表达下调,扮演着潜在的抑癌基因的功能。近来亦有证据表明,miR-15家族成员在一些肿瘤中表达上调,发挥了癌基因的功能,例如miR-15在子宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌表达上调,miR-497在胰腺癌中高表达等。目前miR-15家族成员在肝癌领域中的研究相对局限,在前期实验中我们研究了miR-195和miR-497在肝癌中的表达及预后关系,发现相比癌旁组织,miR-497的表达明显升高,并且和肝癌的侵袭转移相关,这促使我们对其进行深入的探讨。本实验将对miR-497在肝癌中的表达、预后、功能及侵袭转移相关的机制展开研究。方法和结果1、miR-497在肝癌中高表达并且和肿瘤转移复发相关。我们利用Taqman探针检测50例肝癌患者及相应的癌旁组织中miR-497的表达,结果显示miR-497在肝癌中明显上调(P=0.0063)。然后将121例肝癌按有无癌栓,有无复发分组。有癌栓组miR-497的表达量显著高于无癌栓组(P=0.009)。复发组的表达也明显升高(P=0.0303)。我们也证实miR-497在肝癌细胞系中的表达高于肝正常细胞系,高侵袭细胞系的表达高于低侵袭细胞系。2、miR-497与临床病理特征的联系及在肝癌中的预后意义。121例肝癌临床病理特征分析证实miR-497和血管侵犯及TNM分期密切相关(P=0.005,P=0.022)。生存分析结果显示：miR-497和肝癌总生存率(P=0.031)和复发率(P=0.023)相关。高表达miR-497提示较短的生存时间和较大的复发可能。在小肝癌(直径≦5cm)中,miR-497是同时能够提示小肝癌总生存率(P=0.027)和复发率(P=0.020)的临床独立预测因素。3、体外及体内实验证实miR-497促进肝癌细胞的迁移、侵袭及转移。我们在Huh-7,SMMC-7721细胞中(miR-497低表达)构建miR-497稳定株,在MHCC-97H(miR-497高表达)细胞系中干扰miR-497,增殖和克隆形成实验证实干扰或者过表达miR-497后对肝癌细胞的增殖及克隆形成能力无明显的影响。划痕实验、迁徙及侵袭实验证实：过表达miR-497明显促进肝癌细胞的愈合、迁移和侵袭能力。体内实验我们建立经尾静脉肺转移模型,结果显示过表达miR-497明显促进肝癌血行肺转移能力。4、ARHGDIA是miR-497的直接的靶基因我们用TargetScan分析并筛选miR-497可能作用的侵袭相关的抑癌基因,构建UTR,并应用双荧光载体系统验证,发现ARHGDIA3’UTR荧光强度下降明显,而突变结合位点后荧光强度未见变化。过表达miR-497后,SMMC-7721和Huh-7由ARHGDIA蛋白的表达显著下调,而在MHCC-97H细胞中干扰miR-497表达后ARHGDIA的蛋白表达量明显上调。免疫组化和细胞系的表达结果显示ARHGDIA蛋白水平和miR-497存在负相关。5、ARHGDIA在肝癌中的表达、预后及临床病理特征关系我们利用免疫组化方法研究ARHGDIA在肝癌中的表达、预后及临床病理特征关系,石蜡标本为前期miR-497研究的样本,包括86例肝癌标本及40例配对的癌旁组织。免疫组化染色结果显示：ARHGDIA在肝癌中明显低表达(P<0.001),ARHGDIA的表达水平和患者的总生存率和复发显著相关(P=0.017,P=0.012)。ARHGDIA水平低的患者表现术后总生存率降低和比较高的复发概率。临床病理结果提示ARHGDIA的表达水平和肝癌的血管侵润密切相关(P=0.012)。6、ARHGDIA的下调直接介导miR-497促肝癌细胞侵袭和转移的效应。我们运用siRNA干扰SMMC-7721和Huh-7中ARHGDIA的表达,细胞的迁移和侵袭能力明显增强,这种作用类似于miR-497的促肝癌细胞迁移和侵袭作用。而恢复ARHGDIA的表达能够逆转由miR-497所引起的促肝癌细胞的迁移和侵袭的效应。干扰ARHGDIA的表达能够回补miR-497干扰后引起的迁移和侵袭的抑制效果。这些研究结果表明,ARHGDIA在肝癌中起着抑制转移的作用,并且是miR-497直接作用的功能靶点。7、miR-497通过活化RhoA、Rac1、Cdc42,促进肝癌细胞迁移和侵袭。我们利用针对RhoGTPs的活性蛋白的特异抗体,通过免疫共沉淀和细胞免疫荧光实验证实,SMMC-7721细胞miR-497过表达后Cdc42,Racl及RhoA的活性明显增加。miR-497通过靶向抑制ARHGDIA的蛋白表达,从而活化RhoGTP酶,促进肝癌细胞迁移和侵袭,从而诱导肝癌的转移和复发。结论：总之,我们的研究结果证实：miR-497在肝癌中表达上调,并且和肝癌侵袭转移呈正相关；miR-497和肝癌总生存和复发明显相关,高表达miR-497提示较短的生存时间和较大的复发可能,并且在小肝癌(直径≦5cm)是提示总生存率和复发率的临床独立预测因素；体外及体内实验证实miR-497能够促进肝癌细胞的迁移、侵袭及肺转移；ARHGDIA为miR-497直接的靶基因,在肝癌组织明显低表达,并且和患者的总生存率和复发显著相关,表达水平低的患者表现术后总生存率降低和比较高的复发概率。miR-497通过抑制ARHGDIA的蛋白翻译,进而激活RhoA,Cdc42和Rac1,促进肝癌的迁移、侵袭和转移。
【作者】梁磊；
【导师】钦伦秀；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2013，博士
【关键词】miR-497；肝细胞癌；侵袭转移；ARHGDIA；

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