烧伤和肌营养不良时心功能障碍的机制研究

【摘要】研究背景和目的：多器官功能障碍综合征(MODS)是烧伤后三大死亡原因之一。由于心脏在维持全身脏器的正常功能中极其重要，其损害不仅可引起心功能障碍，还可直接引发或加重全身其它组织器官的缺血缺氧性损害。临床上，大面积深度烧伤后，心功能障碍出现早，可诱发或加重休克，成为烧伤后多器官功能障碍的重要因素之一。基础研究中，针对烧伤后心功能障碍的研究发现的潜在机制包括：1.烧伤作为强烈的应激因素，导致机体交感-肾上腺髓质系统处于持续激活状态，血液中高浓度儿茶酚胺持续激活心肌细胞上的β肾上腺素能受体，心肌细胞死亡。2.大量体液渗出，全身血容量不足，心肌局部缺血缺氧，心肌细胞凋亡。3.皮肤和肠道屏障受损，大面积侵入性感染，机体产生多种促炎因子经循环到达心脏，使心肌细胞功能受到抑制。促炎因子前列腺素E2(PGE2)是一种重要的细胞生长和功能调节因子，在各器官包括心脏有广泛的分布，是花生四烯酸环氧合酶代谢产物，为二十碳不饱和脂肪酸。PGE2作为前列腺素(PG)的一种，其主要作用为扩张血管，增加器官血流量，降低血管外周阻力，降低血压，使支气管平滑肌舒张，降低通气阻力。有意思的是PGE2同时具有启动、促进炎症和免疫抑制和抗炎作用。在心肌细胞膜上，PGE2的EP2和EP4都有表达，这些受体被PGE2激活时使心肌细胞cAMP浓度升高。作为机体的应激反应的一部分，当机体受到各种有害刺激，如缺氧、烧伤和创伤等，交感-肾上腺髓质系统兴奋，血中的儿茶酚胺含量也相应增加。在人和动物的心脏中，儿茶酚胺激活β-肾上腺能受体，通过G蛋白-AC-cAMP途径激活蛋白激酶A(PKA)，PKA可使心肌细胞的许多功能蛋白磷酸化，并改变他们的功能活动以适应环境的急变。PGE2和β肾上腺素作为G蛋白偶联受体信号的两个重要成员，各自的信号通路研究已很深入。但在应激条件下，PGE2是否参与和如何调节心脏功能，现在尚无研究。本课题的研究目的是明确严重烧伤和杜氏肌营养不良时心功能障碍发生的过程和分子细胞机理，试图探索PGE2是如何调控心脏和心肌细胞功能和对交感/肾上腺素能受体刺激的反应，揭示其在炎症引起的心脏功能障碍中的可能作用，并探讨PGE2能否成为治疗烧伤后心功能障碍的靶标，为烧伤后心功能障碍提供新的理论基础。方法：第一部分：阻断肠淋巴循环对烧伤后心功能障碍的保护作用本部分实验通过建立大鼠烫伤模型，应用肠系膜淋巴管结扎手术阻断大鼠体内肠淋巴循环入血后，3小时后检测大鼠左心室血流动力学相关指标以确定重度烧伤后心脏功能的早期变化。具体地说，我们将大鼠体表总面积的30%深度烫伤，然后分成三组：(1)对照大鼠(没有烫伤)；(2)30%烫伤大鼠；(3)30%烫伤+肠系膜淋巴管结扎组。3小时后，测定左心室血液动力学指标包括左心室最大上升速率（+dp/dt）、左心室收缩压峰值（LVSP）、左心室发展压(LVDP)、心室出现最大压力速率所需的时间(timeto+dp/dtmax)。第二部分：慢性炎症减弱mdx小鼠心脏的β肾上腺素能反应本部分采用mdx小鼠(肌营养不良症模型)模仿烧伤后长期全身炎症对心脏功能的影响。1.采用超声心动图连续监测2-12月龄mdx和对照小鼠基础心功能并用Masson’s三染色确定心脏组织纤维化。2.采用血流动力学检查连续监测2-12月龄mdx和对照小鼠基础和异丙肾上腺素刺激时的心功能。3.采用灌流心脏、新鲜分离的心肌细胞和Western免疫印迹法从器官、细胞、分子水平解释年轻mdx小鼠(4月龄)心脏和心肌细胞对β肾上腺素反应减弱的机制。4.用PGE2受体阻断剂预处理4月龄mdx小鼠，用血流动力学记录方法研究心脏对异丙肾上腺素的反应。第三部分：PGE2抑制由β肾上腺素能受体激活引起的心脏收缩本部分探讨炎症因子PGE2是如何调控心脏和心肌细胞功能。1.采用Langendorff离体灌流心脏研究不同浓度PGE2对心脏收缩功能的作用；2.采用Langendorff离体灌流心脏研究经过或没经过PGE2预处理心脏对异丙肾上腺素的反应。3.测量经过或没经过10Mrolipram预处理的心肌细胞对0.1MPGE2的反应；4.测量经过或没经过0.1MPGE2预处理的心肌细胞对异丙肾上腺素的反应；5.用Western免疫印迹法测量PDE4的磷酸化水平。结果：第一部分：阻断肠淋巴循环对烧伤后心功能障碍的保护作用1.大面积烧伤引起的急性炎症反应因子通过淋巴回流抑制心脏功能，心功能障碍出现时间早，3小时即可检测到心室内压最大上升速率明显降低。2.阻断肠道淋巴回流后可以部分恢复烧伤后受抑制的心脏功能。第二部分：慢性炎症减弱mdx小鼠心脏的β肾上腺素能反应Mdx小鼠从2月龄开始心肌细胞出现死亡和纤维化，但基础心功能改变在8月龄后才能被发现；1.4月龄mdx小鼠在体和离体心脏对异丙肾上腺素反应都减弱；2.4月龄及4月龄以上mdx小鼠心肌细胞基础收缩功能增强，肌浆网钙含量增高，钙电流增大，但对异丙肾上腺素反应减弱；3.4月龄mdx小鼠心肌细胞RyR2蛋白表达水平和Cav1.21c、受磷蛋白、RyR2磷酸化水平增加，但是Cav1.21c、Cav1.21、Cav1.22、SERCA、Na+/Ca2+交换的表达没有变化；异丙肾上腺素可使这些分子的磷酸化水平增加到与对照小鼠一致。4.4月龄mdx小鼠心肌基础PKA活性增加，但β1肾上腺素受体减少。第三部分：PGE2抑制由β肾上腺素能受体激活引起的心脏收缩1.0.1M的PGE2灌流对心脏几乎没有刺激作用，只有更高浓度的PGE2才能刺激心脏。2.PGE2预处理抑制心脏对异丙肾上腺素的反应。3.用0.1μM的PGE2处理心肌细胞后，心肌细胞收缩幅度和胞质内钙瞬变与未处理细胞无差异，但同时给予心肌细胞0.1μM的PGE2和10μM的rolipram(PDE4选择性抑制剂)药物后，心肌细胞收缩幅度和胞质内钙瞬变显著增高。4.0.1μM的PGE2预处理心肌细胞后可抑制心肌细胞的β肾上腺素反应。未经任何处理的心肌细胞受异丙肾上腺素刺激后表现出正常的β肾上腺素反应；但用0.1μM的PGE2预处理的心肌细胞，当受异丙肾上腺素刺激后，β肾上腺素反应受到明显抑制；但同样用0.1μM的PGE2预处理的心肌细胞，同时给予心肌细胞0.1μM的异丙肾上腺素和10μM的rolipram(PDE4选择性抑制剂)药物后，心肌细胞被抑制的β肾上腺素反应恢复正常水平。5.PGE2预处理心脏PDE4磷酸化水平活性增高,即PDE4的活性升高。结论：本课题研究了烧伤和肌营养不良症中心功能障碍的表现和分子细胞作用机制，探索了炎症因子PGE2在其中可能起的作用。根据以上结果，得出以下结论：1.重度烧伤早期可以通过肠淋巴循环带来的因子抑制心脏功能而肌营养不良症引起的慢性炎症也抑制心脏对交感神经反应。2.PGE2作为重要的促炎因子，在烧伤和肌营养不良症发生后，在全身血液循环中浓度升高；PGE2本身的升高引起的细胞内cAMP的集聚很少而不足以引起心肌收缩力的改变。但是此cAMP足以激活PDE4D亚型而限制由β肾上腺素能受体激活引起的cAMP扩散，从而减弱心脏和心肌细胞对β肾上腺素能的反应。
【作者】李颖；
【导师】彭毅志；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】烧伤；心功能障碍；PGE2；心肌收缩能力；杜氏肌营养不良症；心脏；炎症；β肾上腺素能受体；

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