骨髓来源间充质干细胞通过融合促进肺癌转移的实验研究

【摘要】背景：肺癌尤其是非小细胞肺癌，仍然是世界范围内肿瘤相关死亡率最高的疾病。癌症进展过程中的致命步骤就是肿瘤细胞获得了异常的分子调控机制，从而导致肿瘤转移。然而，肿瘤细胞如何获得这些异常的分子调控，其具体机制目前仍未阐明。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)被认为是肿瘤细胞侵袭、转移过程中的关键步骤。在此过程中，上皮来源的肿瘤细胞获得间质细胞表型，细胞活动能力增强并向远处播散。EMT过程中，播散的肿瘤细胞同时被赋予自我更新能力，以能有效地形成远处转移灶。然而，调控上述过程的具体机制尚不清楚。细胞融合可能为肿瘤细胞获得高转移活性的一种潜在机制。肿瘤性相关间质中的骨髓来源细胞(bonemarrowderivedcells,BMDC)和肿瘤细胞可以通过融合产生含有异常基因表达模式以及高度恶性的细胞亚群。来自于亲代肿瘤细胞的基因组可赋予杂交细胞成瘤性，而骨髓来源细胞可将编码间质表型的基因及高转移活性相关基因赋予杂交瘤细胞从而促进转移。研究证实，体内、外均可检测到骨髓来源细胞与肿瘤细胞之间的自发融合现象。肿瘤相关间质细胞中的骨髓来源细胞中，间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)因具有自我更新及向远处迁移能力等潜在的促肿瘤转移特性而备受关注。MSCs具有较强的“可融合性”，并且是非小细胞肺癌组织中的“常客”。肿瘤浸润的MSCs可通过各种直接或间接效应促进肿瘤进展。总而言之，基于上述证据，我们推测，骨髓来源MSCs可通过与肺癌细胞融合使其获得间质细胞特性和干细胞特性从而促进肺癌转移。由此，本研究旨在体内、外观察A549肺腺癌细胞株、H460大细胞肺癌细胞株以及SK-MES-1肺鳞癌细胞株与MSCs自发融合现象。在此基础上，检测杂交瘤细胞的EMT及干细胞特性以及转移活性，旨在为临床制定抑制肺癌转移的靶向治疗方案提供实验依据。目的：证实人类肺癌细胞与骨髓来源MSCs融合产生的杂交瘤细胞是否获得EMT以及干细胞特性，并阐明肺癌细胞与骨髓来源MSCs之间的自发融合是一种促进肺癌转移的潜在机制，并为通过干预细胞融合从而抑制肿瘤转移提供实验依据。方法：(1)体外共培养MSCs-RFP及肺癌细胞-EGFP，荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察RFP及EGFP双阳性的杂交瘤细胞，流式分选杂交瘤细胞。将基因错配的MSCs和HCC827肺癌细胞共培养或混合后注入NOD/SCID免疫缺陷小鼠皮下，性染色体标记的荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，FISH)技术检测杂交瘤细胞。(2)倒置显微镜下观察杂交瘤细胞的细胞形态。免疫荧光及实时定量聚合酶链反应(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,QRT-PCR)检测上皮、间质标志物表达。QRT-PCR检测杂交瘤细胞及亲代肺癌细胞中EMT相关转录调控因子的表达。(3)流式及QRT-PCR检测CD133表达。QRT-PCR检测干性调控因子的表达。软琼脂克隆球形成实验及无血清干细胞培养基克隆球形成实验检测杂交瘤细胞体外克隆球形成能力。构建NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型，观察杂交瘤细胞的体内成瘤能力。(4)体外细胞侵袭、迁移实验检测细胞的活动能力。构建裸鼠尾静脉移植瘤模型，观察杂交瘤细胞在裸鼠体内的转移能力。结果：(1)体内外均可检测到MSCs与肺癌细胞自发融合形成的杂交瘤细胞。(2)杂交瘤细胞呈散在分布且呈现成纤维细胞样细胞形态，多有两个或多个核。免疫荧光检测显示，杂交瘤细胞上皮性标志物表达显著降低，而间质性标志物表达明显升高。QRT-PCR显示，杂交瘤细胞中E-cadherinmRNA表达明显下调，而间质标志物及EMT相关转录因子mRNA表达明显上调。(3)流式检测显示杂交瘤细胞过表达CD133。QRT-PCR检测也显示CD133mRNA表达明显上调，且相关干性调控因子的mRNA表达亦上调。杂交瘤细胞体外克隆球形成能力及体内成瘤能力均较亲代肺癌细胞明显增强。(4)杂交瘤细胞体外侵袭、迁移能力及体内肺、肝转移灶形成能力均较亲代肺癌细胞明显增强。结论：(1)MSCs与肺癌细胞在体内、外均能自发融合。(2)MSCs与肺癌细胞通过自发融合可产生同时具有EMT特性及干细胞特性的高恶性程度的细胞亚群。(3)MSCs与肺癌细胞通过自发融合形成杂交瘤细胞是产生高侵袭、转移活性的肺癌细胞的一种潜在机制。
【作者】徐梅华；
【导师】刘国祥；
【作者基本信息】第三军医大学，内科学，2014，博士
【关键词】肺癌；间充质干细胞；细胞融合；上皮-间质转化；肿瘤干细胞；转移；

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