Brg1和Brm对CAMs和ET-1的转录调控及其在低氧性肺动脉高压中的作用和机制研究

【摘要】研究背景：低氧性肺动脉高压(HypoxiaPulmonaryHypertension，HPH)是由低氧引起的以持续肺动脉压力增高、肺血管结构改建，并伴有右心室肥大的慢性进行性疾病，是高原心脏病和肺源性心脏病发病的中心环节。HPH的形成是一个复杂的病理生理过程，已有研究表明，炎症免疫反应和血管活性物质分泌失调是其中的两个重要机制。炎症免疫细胞在血管壁的黏附聚集是炎症发生的起始环节，而血管内皮细胞中ICAM-1、VCAM-1和E-selectin等细胞黏附分子(celladhesionmolecules，CAMs)是其中的关键作用分子。低氧时内皮细胞中CAMs基因转录激活，促进循环免疫细胞的黏附聚集和血管周围炎症微环境的形成，引起肺动脉高压和肺血管结构改建。内皮素1(Endothelin1，ET-1)是内皮细胞分泌的缩血管作用最强的活性多肽，低氧可诱导ET-1表达上调，参与HPH的发生。目前已知，CAMs和ET-1基因表达受核因子kB(NuclearfactorkappaB，NF-kB)、低氧诱导因子1α(Hypoxiainduciblefactor1α，HIF-1α)和巨核细胞性白血病因子1(Megakaryocyticleukemia1，MKL1)等转录因子调节。低氧时上述转录因子进入核内增多，与启动子序列特异结合，启动基因转录和表达。真核细胞的DNA由组蛋白包裹形成核小体乃至染色体，基因转录时首先需要打开核小体结构，暴露启动子序列，即染色质重构。Brahma-relatedgene1(Brg1)和brahma(Brm)是哺乳动物染色质重构复合物SWI(mating-typeswitching)/SNF(sucrosefermentation)的核心ATP酶亚单位，两者结构相似、功能互补。Brg1和Brm可以水解ATP释放能量实现对核小体的重排和置换，从而调节靶基因的转录。研究表明，Brg1和Brm在胚胎发育过程中的血管平衡维持和应激相关疾病发生中都具有重要作用。最新研究发现，HIF-1α可以招募Brg1和Brm至其靶基因，参与细胞低氧反应，但Brg1和Brm是否及如何参与低氧诱导的CAMs及ET-1转录调控，进而促进HPH的发生和发展，迄今未见报道。因此，本研究在明确低氧诱导肺血管及内皮细胞中Brg1和Brm基因表达的基础上，研究其对内皮细胞CAMs和ET-1转录调控的作用及机制；特异干扰内皮细胞中的Brg1和Brm，进一步探讨Brg1和Brm在肺血管结构改建和HPH形成中的作用和机制。为干预或预防HPH提供新的思路和有效靶点。方法：1.模拟海拔5000m高原28d复制雄性SD大鼠HPH模型，分离肺动脉；将人肺动脉内皮细胞(Humanpulmonaryarterialendothelialcell，HPEC)和人脐静脉内皮细胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)低氧(1%O2)处理24h；RT-qPCR及WB法检测肺动脉及内皮细胞中Brg1和Brm基因的mRNA及蛋白表达。2.通过外源性质粒转染内皮细胞(HPEC、HUVEC)过表达或siRNA转染干扰内源性的Brg1和Brm基因，采用报告基因法检测CAMs启动子转录活性；采用RT-qPCR及WB方法检测CAMs基因的mRNA及蛋白表达；采用细胞黏附实验检测内皮细胞的黏附功能。为了进一步探讨低氧时Brg1和Brm激活CAMs转录的机制，采用染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，CHIP)方法检测低氧后Brg1和Brm与内皮细胞中CAMs启动子的结合水平；siRNA转染干扰Brg1和Brm后，进一步运用CHIP方法检测NF-kB/p65与CAMs启动子的结合水平，同时运用CHIP方法检测CAMs启动子周围AcH3和H3K4M3等组蛋白修饰变化。3.内皮细胞(HPEC、HUVEC)中外源性质粒转染过表达或siRNA干扰内源性的Brg1和Brm基因，采用报告基因法检测ET-1启动子的转录活性；采用RT-qPCR及ELISA法检测ET-1的mRNA表达；采用CHIP方法检测低氧后特异结合在内皮细胞(HUVEC)ET-1启动子上的Brg1和Brm以及MKL1蛋白水平；siRNA转染干扰Brg1和Brm后，采用CHIP方法检测ET-1启动子周围AcH3和H3K4M3等组蛋白修饰变化。4.将雄性C57/BL6小鼠随机分为常氧组、低氧组、低氧对照病毒组和低氧Brg1/Brm干扰病毒组。常氧组和低氧组给予生理盐水，低氧对照病毒组给予对照病毒液，低氧Brg1/Brm干扰病毒组尾静脉注射内皮细胞特异性Brg1/Brm干扰质粒慢病毒敲减Brg1和Brm基因表达；低氧各组置于低压氧舱内模拟海拔5000m低氧处理28d复制小鼠HPH模型。采用导管法检测右心室血流动力学指标；采用HE染色及免疫组化(Immunohistochemisty，IHC)染色检测肺血管改建，采用免疫荧光(Immunofluorescence，IF)法检测肺血管内皮细胞中Brg1和Brm的表达以及肺血管周围炎症细胞浸润；采用RT-qPCR法检测肺组织中CAMs的表达；采用ELISA法检测肺组织匀浆IL-1β、IL-6、MCP-1、TNF-α等炎症因子的表达；采用CHIP法检测低氧后肺组织中Brg1和Brm与ICAM-1启动子的结合水平。结果：1.低氧可显著上调SD大鼠的肺动脉(5000m，28d)和内皮细胞(HPEC、HUVEC，1%O2，24h)Brg1和Brm的mRNA和蛋白表达。2.内皮细胞(HPEC、HUVEC)中过表达Brg1和Brm能显著增强低氧(1%O2，24h)诱导的CAMs启动子转录活性，且该作用依赖于其酶催化活性；过表达Brg1和Brm显著上调内皮细胞中内源性CAMs的mRNA和蛋白表达；敲减Brg1和Brm基因可显著抑制低氧诱导的CAMs启动子转录活性增强和内皮细胞内源性CAMs表达，且内皮细胞与白细胞的黏附作用降低。CHIP实验显示低氧能显著增加Brg1和Brm在内皮细胞CAMs启动子上p65的结合区域的结合；干扰内皮细胞中的Brg1和Brm能显著抑制p65与CAMs启动子的结合，CAMs启动子周围AcH3和H3K4Me3等具有转录活化作用的组蛋白也显著减少，PolII的招募也显著减少。3.内皮细胞(HUVEC)中过表达Brg1和Brm能显著增强低氧诱导的ET-1启动子转录活性，酶失活的Brg1和Brm并不增强ET-1启动子转录活性；干扰内皮细胞(HPEC、HUVEC)中的Brg1和Brm能显著抑制ET-1启动子的转录活性以及ET-1的表达和分泌；CHIP实验发现低氧能显著增加Brg1和Brm以及MKL1在内皮细胞(HUVEC)ET-1启动子上的结合；干扰Brg1和Brm后，ET-1启动子周围AcH3和H3K4Me3等具有转录活化作用的组蛋白也显著减少。4.成功构建HPH小鼠模型，IF结果显示干扰病毒组小鼠肺血管内皮细胞中Brg1和Brm的表达显著降低；伴随着肺血管内皮细胞中Brg1和Brm的表达抑制，肺组织中CAMs基因的mRNA表达也显著降低，小鼠右心室收缩压和肥厚指数也显著降低，肺血管厚度显著变薄，肺血管重构显著改善，肺血管周围炎症细胞浸润显著减少，肺组织匀浆中IL-1β、IL-6、MCP-1的分泌显著降低。CHIP结果显示HPH小鼠肺组织中的Brg1和Brm被更多的招募到ICAM-1的启动子上。结论：1.HPH大鼠肺血管中Brg1和Brm基因表达增多，内皮细胞可能是其中一种重要效应细胞；2.Brg1和Brm介导低氧内皮细胞中CAMs转录和表达，参与调节低氧内皮细胞与白细胞的黏附作用，其作用机制依赖与NF-kB/p65的相互作用，以及对CAMs启动子周围的组蛋白修饰的影响；3.Brg1和Brm参与调控低氧内皮细胞中ET-1转录和表达，其作用机制依赖与MKL1的相互作用及其对ET-1启动子周围组蛋白修饰的调节作用；4.特异干扰HPH小鼠内皮细胞中Brg1和Brm基因，可显著降低右心室收缩压、抑制肺血管重构和右心室肥厚；其机制与CAMs及ET-1转录抑制并表达降低、肺血管周围炎症细胞浸润减少和炎症细胞因子表达降低密切相关；5.肺血管内皮细胞中的Brg1和Brm基因在HPH的形成中发挥重要作用，有望成为干预或防治HPH的有效靶点。
【作者】陈德伟；
【导师】高钰琪；
【作者基本信息】第三军医大学，高原医学，2014，博士
【关键词】低氧性肺动脉高压；Brg1；Brm；CAM；ET-1；炎症反应；染色质重构；组蛋白修饰；

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