脑缺血缺氧中缺氧诱导因子HIF-1α对小胶质细胞自噬调节的机制研究

【摘要】缺血性脑卒中是一种由于脑血流中断并导致神经功能障碍的疾病。缺血性脑卒中的发病率在急性脑血管中占有很高的比例，并且具有很高的伤残率，已严重危害了人类的健康。根据相关研究调查，我国老年患者每年新发缺血性脑卒中的人数达到120-150万左右，其中死亡人数达到80-100万左右。在幸存患者中，半数以上伴有不同程度的神经功能残疾。随着我国的老龄人口的逐渐增加，缺血性脑卒中的发病人数将进一步增加。因此，缺血性脑卒中成为人类健康的头号敌人，深入研究缺血性脑卒中的发病机制及治疗策略具有重要的科学意义和临床价值。当前对于缺血性脑卒中的发病机制及治疗策略提出了全新的概念-血管神经网络学说。该学说研究认为：血管内皮细胞、神经元、胶质细胞以及周围细胞外基质等成分有机组成了血管神经单元复合体。复合体内的各种细胞成分及复合体之间互相影响和调控，形成了网络结构。该学说认为缺血性脑卒中不是单纯的血管事件，也不是单存的神经事件，而是血管与神经之间，实质细胞与基质之间的相互影响和对话，互相调节和平衡的作用过程。因此，在缺血性脑卒中后，所有的神经细胞和细胞成分都应该受到重视和保护，而不是单纯保护某种细胞。在以前的缺血性脑卒中的大量相关研究都关注神经元细胞和血管内皮细胞，而缺乏对胶质细胞的深入研究。目前逐渐认为：小胶质细胞介导的炎症反应在缺血性脑卒中后发挥重要的损伤作用。小胶质细胞与正常细胞一样，在缺氧环境下均能感受低氧信号的刺激，并能活化相应的信号通路，启动相应基因的表达，适应低氧微环境对细胞的有害作用，并维持细胞内环境的稳定。当细胞受到低氧信号刺激后，有多种基因诱导表达。其中低氧诱导因子(HIF-1)发挥重要的作用。研究表明HIF-1可以在缺氧环境下迅速启动下游相关基因的活化，调节细胞内的能量代谢水平和对氧的利用，在机体器官或局部组织发挥对低氧适应能力中具有重要作用。在营养缺乏、损伤等外界有害环境下，特别是缺氧应激下，细胞能通过启动HIF-1的分子开关作用，使下游基因的表达做到准确的精细调控，并使细胞维持基本的能量代谢。自噬(Autophagy)是生物在进化过程中保留的一种特殊的现象。本质是细胞在生存、发育、分化及代谢过程中的一种溶酶体降解途径。其主要的作用是保护机体内环境的稳定，并避免受到外界各种因素的影响。新近研究表明，自噬除了维持细胞自身环境的平衡以外，还作为一种重要的分子调控机制，参与了众多的基因的调节和多种疾病的发生，如代谢病、心脏病、遗传病、肿瘤、炎症及神经疾病等。研究报道在缺氧过程中，自噬变化明显，并影响细胞的病理及生理学效应。然后在脑缺血缺氧环境下，小胶质细胞的病理生理学特点是怎样的？HIF-1α的在小胶质细胞上的表达情况如何？小胶质细胞是否有自噬发生？其具体发生及调节机制又是怎样的？干扰上述环节是否对脑缺血的神经功能具有保护作用？为了证实上述的疑问，我们在本研究中设计系列实验，以明确在脑缺血缺氧环境下HIF-1α的表达对小胶质细胞的自噬影响及生物学意义。研究内容：①在体外应用氧糖剥夺模型，在0-48小时的不同时间点，应用PI和MTT检测小胶质细胞的生存率；②体外应用氧糖剥夺模型，在0-48小时的不同时间点，应用RT-PCR和ELISA检测小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量；③体外应用氧糖剥夺模型，在0-48小时的不同时间点，应用westernblot检测小胶质细胞的HIF-1α表达量；④体外应用氧糖剥夺模型，分别用HIF-1α的抑制剂2ME和YC-1以及HIF-1α的RNA阻断HIF-1α的表达，应用PI和MTT检测小胶质细胞的生存率；⑤体外应用氧糖剥夺模型，分别用HIF-1α的抑制剂2ME和YC-1以及HIF-1α的RNA阻断HIF-1α的表达，应用ELISA检测小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量；⑥体外应用氧糖剥夺模型，在0-48小时的不同时间点，应用westernblot检测检测小胶质细胞自噬相关蛋白LC3的表达变化；应用激光共聚焦显微镜观察小胶质细胞的GFP-LC3质粒表达变化；应用MDC(单丹磺酰尸胺)及丫啶橙染色，流式细胞仪分析小胶质细胞自噬相关的情况；电子显微镜检测小胶质细胞自噬囊泡的形成；⑦体外应用氧糖剥夺模型，分别用HIF-1α的抑制剂2ME和YC-1以及HIF-1α的RNA阻断HIF-1α的表达，通过上述手段检测对小胶质细胞自噬的影响；⑧体外应用氧糖剥夺模型，分别用自噬的抑制剂3-MA和BafA1，以及促进剂Rapa作用小胶质细胞，检测小胶质细胞的存活率；运用自噬关键调节蛋白Beclin1的RNAi作用小胶质细胞，检测小胶质细胞的存活率；⑨建立小鼠大脑中动脉栓塞模型，检测缺血区小胶质细胞的自噬及小鼠神经功能情况；⑩建立小鼠大脑中动脉栓塞模型，侧脑室注射自噬的抑制剂3-MA，检测抑制自噬后，缺血区小胶质细胞的自噬及小鼠神经功能情况。我们的研究得出了以下结果：①在体外氧糖剥夺模型中，随着时间延长，小胶质细胞的死亡率逐渐增加，存活率逐渐下降；②在体外氧糖剥夺模型中，随着时间延长，炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量逐渐增加；③体外氧糖剥夺模型型中，阻断HIF-1α的表达，小胶质细胞的死亡率下降，存活率增加；⑤体外氧糖剥夺模型中，阻断HIF-1α的表达，小胶质细胞的炎症细胞因子IL-8和TNF-α表达量减少；⑥体外氧糖剥夺模型中，小胶质细胞自噬增加；⑦体外氧糖剥夺模型中，阻断HIF-1α的表达，小胶质细胞自噬减少；⑧体外氧糖剥夺模型中，抑制自噬及Beclin1蛋白，小胶质细胞的死亡率减少，存活率增加；促进自噬，小胶质细胞的死亡率增加，存活率减少；⑨体内小鼠大脑中动脉栓塞模型中，缺血区的小胶质细胞自噬增加，小鼠神经功能受损；自噬抑制剂3-MA能减轻缺血区的小胶质细胞自噬及小鼠神经功能缺损情况。研究结论：脑缺血缺氧环境诱导小胶质细胞HIF-1α表达上调，并通过Beclin1信号通路启动自噬途径，导致了细胞的炎症和死亡效应，并进一步加重了神经功能损伤。干扰自噬途径，可以抑制小胶质细胞的炎症和死亡效应，为缺血性脑卒中提供了理想的脑保护策略。
【作者】杨曌；
【导师】冯华；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】缺氧；HIF-1α；小胶质细胞；自噬；脑保护；

【参考文献】
[1]童天培.竖向荷载作用下预应力混凝土管桩承载力分析研究[D].安徽建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[2]赵红姝.天然药物组方治疗糖尿病性视网膜病变的临床研究[D].吉林大学,眼科学,2004,硕士.
[3]杨立新.激光聚变实验中等离子体的轴对称三维重建方法研究[D].国防科学技术大学,物理学,2012,硕士.
[4]KJ.1128.石墨烯质子传导膜可让燃料电池更高效[J].军民两用技术与产品,2015,01:37.
[5]罗洋.基于案例推理的糖尿病诊断系统的研究与应用[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[6]郑春晔,杨萍.高校危机事件中的媒体应对能力探究[J].教育教学论坛,2013,17:10-12.
[7]计时鸣,李宜燃,谭大鹏.基于软性磨粒流抛光超声波激振湍流强化的初步研究[J].机电工程,2013,03:261-266.
[8]刘广.呼和浩特市旅游竞争力研究[D].内蒙古师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[9]蔡瑞岚.“界变”论下的句末“了”及其教学[D].吉林大学,汉语国际教育（专业学位）,2013,硕士.
[10]刘又铭,张锦.石墨烯包覆金属纳米颗粒的合成及其在SERS中的应用[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[11]蒋红波.氨基和羧基偶氮苯功能化聚合物的合成及性能研究[D].西南大学,有机化学,2013,硕士.
[12]郭光辉.组合服务分布式执行优化技术研究[D].西安电子科技大学,计算机软件与理论,2011,硕士.
[13]李挺.乡镇政府在农村养老保险中公共责任研究[D].青岛大学,行政管理,2013,硕士.
[14]刘淑欣.机电集成电磁蜗杆的加工技术研究[D].燕山大学,机械工程,2014,硕士.
[15]蔡言龙.全地面起重机多桥油气悬架系统的仿真研究[D].太原科技大学,车辆工程,2014,硕士.
[16]秦梦.我国金融消费者权益保护法律问题研究[D].辽宁大学,经济法学,2012,硕士.
[17]赵昕宇.风光互补发电潜力分析与系统优化设计研究[D].河南农业大学,农业生物环境与能源工程,2014,博士.
[18]张行.物流企业中客户关系管理模型的研究和应用[D].大连海事大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[19]常芮彬.美国报纸中国家身份的多模态话语分析[D].西南大学,英语语言文学,2013,硕士.
[20]王振文.核电一回路安全端焊接接头SCC裂纹扩展速率研究[D].西安科技大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[21]熊鑫.货币政策波动引起的应计与真实盈余管理研究[D].重庆大学,会计学,2014,硕士.
[22]吴得安.中西结合治疗尘肺119例的临床研究[D].甘肃中医学院,中西医结合,2014,硕士.
[23]刘泉君.创业板公司股权集中度及股权制衡度对业绩的影响[D].北京交通大学,2013.
[24]杜春娟1,梁红1*,高大文1,2,刘畅1.实际生活污水快速培养好氧颗粒污泥的方法研究[J].环境保护科学,2015,03:.
[25]廖建军.基于计算机视觉的石材轮廓提取及缺陷检测[D].沈阳建筑大学,车辆工程,2013,硕士.
[26]吴卫华,江晶,高岚.机载雷达辅助无源传感器对杂波环境下机动目标跟踪[J].控制与决策,2015,02:277-282.
[27]罗杨合.铂、蛋白质和阳离子表面活性剂纳米微粒的Rayleigh散射光谱研究及应用[D].广西师范大学,无机化学,2003,硕士.
[28]马英华.冻存神经异体移植在大鼠坐骨神经损伤修复中应用的研究[D].承德医学院,肿瘤学,2011,硕士.
[29]李普,陈南,孙庆鸿.复合摄动的有源结构声辐射系统鲁棒H~∞控制研究[J].控制与决策,2000,03:348-351.
[30]杨晋儒.No.7信令设备的测试[J].现代电信科技.1994(05)
[31]王坤.上市公司高管薪酬法律规制研究[D].河北大学,经济法学,2014,硕士.
[32]张庆华.感性工学在SUV车身形态设计中的应用[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[33]方中华.基于融合元的数据融合系统进化体系结构研究[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,2003.
[34]薛将.脉冲激光沉积法制备钽掺杂二氧化钛薄膜的研究[D].南京航空航天大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[35]蒋丹彤.中国当代题材电视剧对外传播的跨文化传播解读——以《媳妇的美好时代》在非洲传播为例[J].现代视听,2014,02:9-11.
[36]关旭鹏.分布式舰载雷达目标跟踪和数据融合仿真[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2014,硕士.
[37]熊忠阳,张玉芳,吴中福.数据仓库数据加载技术[J].重庆大学学报(自然科学版),2002,02:106-108.
[38]翟苹利.一种改进的快速代理移动IPv6切换方案研究[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[39]潘炜.我国商业银行碳金融发展战略研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]冯林.Toll样受体9、核因子-κB和CD20在干燥综合征患者唇腺组织中的表达及临床意义[D].蚌埠医学院,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[41]赵紫伟.何首乌生熟异用作用机理的研究[D].云南中医学院,中药学,2012,硕士.
[42]程成,萧蕴诗,岳继光.一种基于单位超球面平均的盲反卷积方法[J].控制与决策,2010,05:758-762.
[43]王晓强.区域的布尔操作和参数曲线的分段生成算法研究与实现[D].沈阳工业大学,计算机应用技术,2003,硕士.
[44]李丹武.基于crossbar的高性能多播交换技术研究[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[45]陈尧红.基于网络的视频监控系统[D].浙江大学,2006.
[46]关欣,孙贵东,衣晓,郭强.基于不等长序列相似度挖掘的数据关联算法[J].控制与决策.
[47]王良群.提升企业核心竞争力的人力资源管理对策研究[D].中国海洋大学,企业管理,2003,硕士.
[48]张丹.邯邢地区铁矿成矿地质特征及成矿模式研究[D].石家庄经济学院,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[49]刘伟,杨琦,李博,陈海,聂兰玉.磁性石墨烯吸附水中Cr(Ⅵ)研究[J].环境科学,2015,02:537-544.
[50]陈义祥.猪瘟抗体监测ELISA试剂盒的研制[D].广西大学,预防兽医学,2003,硕士.