表观遗传学修饰在妇科肿瘤诊断中的应用价值研究

【摘要】表观遗传学修饰(Epigenetics)是指在不改变DNA序列的前提下,细胞内其他可遗传物质发生改变而引起的基因表达或细胞表型变化,这种改变在胚胎发育和细胞增殖过程中能稳定遗传且具有可逆潜能。表观遗传学修饰主要包括两大类,一类是基因选择性转录表达的调控,主要包括DNA甲基化、染色质重塑、组蛋白修饰、基因组印记、基因沉默、核仁显性及休眠转座子激活等,另一类为基因转录后的调控,主要包括基因组中非编码RNA.MicroRNA.反义RNA.内含子及核糖开关等。与经典遗传学以研究基因序列影响生物学功能为核心相比,表观遗传学主要研究这些“表观遗传现象”建立和维持的机制,作为经典遗传学的补充,表观遗传学让我们更全面的理解基因调节的机制。近年来研究已证实表观遗传学修饰在干细胞分化,早期胚胎发育及多种疾病(肿瘤、自身免疫疾病及代谢性疾病等)的发生发展过程中具有重要作用；特别是在肿瘤研究领域,表观遗传学修饰与原癌基因激活、抑癌基因失活、DNA损伤修复缺陷及肿瘤干细胞分化等密切相关。针对肿瘤表观遗传学机制研究的最终目的是为了应用于临床诊断及预防治疗。DNA甲基化和MicroRNA在诊断方面的研究已经趋于成熟,Fujiwara等研究表明5个基因血清游离DNA甲基化谱在诊断早期肺癌方面特异性和阳性预测值分别为85%和75%,同样众多研究表明MicroRNA表达谱可应用于乳腺癌的病理分型(如雌孕激素受体状态、肿瘤分期、肿瘤转移及Her2状态等)。本研究主要研究DNA甲基化及MicrORNA表达谱在早期上皮性卵巢癌及子宫平滑肌肿瘤诊断分类中的应用。第一部分：多重巢式甲基化特异性PCR在早期上皮性卵巢癌诊断中的应用研究背景和目的卵巢癌发病率位居女性恶性生殖系统肿瘤第三位,病死率居第一位,占所有因癌症死亡女性患者的3%,其中90%以上为上皮性卵巢癌。卵巢癌发病隐匿,临床确诊时约85%患者疾病己为晚期(FIGOⅡ-Ⅳ期),5年生存率仅为30-44%,而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高达93%。因此,除积极寻找新的有效的治疗方式外,探讨卵巢癌发生发展的生物学机制,研发新型卵巢癌早期诊断技术迫在眉睫。目前尚无简便有效的、可常规应用的卵巢癌早期诊断方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌标志物,但仅有50%的Ⅰ期卵巢癌患者CA125水平升高,且其他疾病(如子宫内膜异位症、卵巢纤维瘤、盆腔炎性疾病及某些其他恶性肿瘤等)亦可引起CA125水平升高,故其敏感性和特异性较差,卵巢癌阳性预测值仅有100%～35%。总体而言,对于血清CA125检测、经阴道超声探查等传统的诊断方法单一或联合应用,目前均无证据显示可降低人群的卵巢癌发病率和(或)病死率,其主要原因在于这些方法的假阴性或假阳性率均过高,敏感性和特异性达不到临床需要。DNA甲基化,即在DNA甲基转移酶的催化下将甲基转移到胞嘧啶的第5位碳原子上生成5-甲基胞嘧啶,是重要的表观遗传学机制。DNA启动子区异常高甲基化是抑癌基因失活的重要机制,在某些情况下可能是唯一的机制,在癌症发生发展中发挥重要作用。作为癌症发生的早期事件,DNA异常甲基化检测可以在患者出现临床表现或者影像学证据之前做到分子诊断,为癌症早期诊断提供新的途径。现己证实肿瘤患者中血清游离DNA含量明显升高,其来源主要有2种机制：1、增殖旺盛的肿瘤细胞持续释放DNA进入血液循环；2、肿瘤细胞的坏死、凋亡或直接入血裂解使血清游离DNA含量增高。血清游离DNA具有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变(如启动子区高甲基化、基因突变、微卫星不稳定和杂合性缺失等),可间接反映肿瘤的发生发展情况。使用血清游离DNA甲基化检测在其他癌症如肺癌、头颈部肿瘤、前列腺癌等己被证实可行,因此卵巢癌患者血清游离DNA甲基化检测,是一种可行的具有临床实用价值的卵巢癌早期诊断技术。针对血清游离DNA微量,甲基化特异性PCR敏感性不足的特点,课题组将多重PCR、巢式PCR与甲基化特异性PCR相结合,开发出全新的多重巢式甲基化特异性PCR(Multiplex-MSP)检测方法,已满足血清微量肿瘤游离DNA样本多基因甲基化检测需要。材料和方法1.上皮性卵巢癌特异性甲基化基因的筛选。2.临床卵巢肿瘤及正常对照病人血清及组织样本的收集。3.引物的设计合成及多重巢式甲基化特异性PCR反应体系的优化。4.多重巢式甲基化特异性PCR检测血清及组织样本甲基化水平。5.卵巢癌血清与组织甲基化谱对照研究。6.回顾性分析评估多重巢式甲基化特异性PCR检测在上皮性卵巢癌早期诊断中的意义。7.双盲实验进一步验证多重巢式甲基化特异性PCR检测在上皮性卵巢癌早期诊断中的作用。结果1.通过Pubmed检索筛选出7个与卵巢癌发生发展密切相关的高频甲基化基因APC,RASSF1A,CDH1,RUNX3,TFP12,SFRP5和OPCML。2.将多重PCR、巢式PCR与甲基化特异性PCR相结合,开发出全新的多重巢式甲基化特异性PCR检测方法。3.应用多重巢式甲基化特异性PCR对20例卵巢癌血清及配对组织进行检测,证实血清游离DNA甲基化谱完全包含于肿瘤组织DNA甲基化谱。4.应用多重巢式甲基化特异性PCR回顾140例卵巢肿瘤及正常女性血清标本,结果证实该方法的特异性为90.57%,敏感性为89.66%；特别是在背景和目的临床上,常见的子宫平滑肌肿瘤主要包括良性子宫平滑肌瘤和恶性子宫平滑肌肉瘤,它们的分类主要基于以下三个标准：细胞异型性、有丝分裂相、肿瘤细胞坏死,典型的子宫平滑肌瘤形态学上主要表现为无细胞异型性,小于10MF/10HPF的有丝分裂相,可能会表现出玻璃样坏死(如缺血性),但缺乏典型的凝固性肿瘤细胞坏死；相反,恶性子宫平滑肌肉瘤至少具备以下3个特征中的2个,明显的细胞异型性,大于10MF/10HPF的有丝分裂相及典型的凝固性肿瘤细胞坏死。在典型的子宫平滑肌瘤和子宫平滑肌肉瘤之间,存在几大类中间类型的子宫平滑肌肿瘤,它们表现一些但不是所有的恶性肿瘤的特征,主要包括以下几大类：不典型性、恶性潜能未定型、有丝分裂活跃型、富于细胞性等,它们的诊断标准主要依据1994年发表的Bell准则及2003年WHO肿瘤分类标准。除典型的良性子宫平滑肌瘤外,其他类型的子宫平滑肌肿瘤发病率很低,诊断也存在一定的分歧,对它们的研究大部分集中于临床及病理阶段,其分子生物学研究较少。传统观点认为,1、子宫平滑肌肉瘤为突然发生(denovo),没有癌前病变；2、不典型性子宫平滑肌瘤是普通子宫平滑肌瘤的一个变种,属于良性病变。但随着目前对各类型子宫平滑肌肿瘤的分子生物学研究进展,这两个观点受到了挑战。临床上对不典型性子宫平滑肌瘤没有明确的诊疗指南,但根据文献报道,这类肿瘤虽然具有高治愈率和低复发率的特点,但也有病例(3/18)死于这类疾病,但与子宫肉瘤相比有更长的潜伏期(>6年vs2.1年),在临床实践中,我们也看到极个别的不典型性子宫平滑肌瘤在短时间内进展成为子宫肉瘤的情况；另外不典型性子宫平滑肌瘤部分存在染色体1p缺失,与典型的子宫肌瘤相比与平滑肌肉瘤更为相似。在前期研究中,课题组对167例不同类型的子宫平滑肌肿瘤从组织形态学、基因突变、染色体变异及免疫组化角度进行了整体分析。研究显示,MED12基因突变在不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤中的突变率均低于15%(P>0.05),普通子宫平滑肌瘤突变率为75%；P53基因突变在不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤中的突变率分别为12%和24%(P>0.05),而普通子宫平滑肌瘤未发现突变；PTEN缺失在不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤中也具有相似的缺失频率(P>0.05)。课题组进一步挑选与子宫平滑肌肉瘤发生发展相关的关键蛋白,进行免疫组化染色,聚类分析显示不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤具有相似的蛋白表达谱。基于以上研究基础,课题组假设不典型性子宫肌瘤可能代表有能力演变为子宫平滑肌肉瘤的中间形式,可能是其癌前病变。本研究着重从MicroRAN表达谱、DNA甲基化角度对子宫平滑肌肿瘤进行研究,以寻求不典型性子宫肌瘤可能是子宫平滑肌肉瘤的癌前病变这一假说的更多证据。材料和方法1.收集美国NorthwesternUniversity,Northwesternmemorialhospital及山东大学齐鲁医院1993～2013年185例不同类型的子宫平滑肌肿瘤(包括38例子宫平滑肌肉瘤、42例不典型性子宫平滑肌瘤、18例恶性潜能未定的子宫平滑肌瘤、22例富于细胞性子宫平滑肌瘤、7例有丝分裂活跃型子宫平滑肌瘤及58例普通子宫平滑肌瘤),所有病例均有完整的临床、病理及随访资料。2.提取组织形态学最典型的子宫平滑肌肉瘤,不典型性子宫平滑肌瘤,恶性潜能未定的子宫平滑肌瘤,富于细胞性子宫平滑肌瘤,普通子宫平滑肌瘤及正常子宫肌层各8例RNA,利用FirePlexTM平台行miRNA表达谱分析。3.提取18例普通子宫平滑肌瘤及配对子宫肌层新鲜组织DNA,利用InfiniumHumanMethylation27KBeadChip行全基因组甲基化谱分析。4.提取30例子宫平滑肌肉瘤,25例不典型性子宫平滑肌瘤,12例普通子宫平滑肌瘤及6例正常子宫肌层DNA,利用SequenomMassArray甲基化检测平台对候选基因(KLF11、DLEC1及RUNX3)进行启动子CpG岛甲基化分析。结果1.非监督聚类分析及马氏距离分析均显示不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表达谱。2.InfiniumHumanMethylation27KBeadChip筛选出子宫平滑肌瘤相对正常子宫肌层显著高甲基化的基因KLF11及DLEC1(P<0.001).3.不典型性子宫平滑肌瘤中KLF11、DLEC1及RUNX3甲基化谱与子宫平滑肌肉瘤相近(P>0.05),而与子宫平滑肌瘤差异显著(P<0.05)。4.结合课题组前期研究结果,对全部类型的子宫平滑肌肿瘤进行主成成分3D距离分析,发现不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤距离最为接近。结论1.相对于普通子宫平滑肌瘤,不典型性子宫平滑肌瘤与子宫平滑肌肉瘤有相似的MicroRAN表达谱及甲基化谱,从表观遗传学角度提示不典型子宫平滑肌瘤可能为子宫平滑肌肉瘤的癌前病变。2.临床上,不典型性平滑肌瘤的处理原则应不同于普通子宫平滑肌瘤,须严密随访。
【作者】张青；
【导师】孔北华；魏建军；
【作者基本信息】山东大学，妇产科学，2014，博士
【关键词】上皮性卵巢癌；Multiplex-MSP；血清游离DNA；早期诊断；41例早期卵巢癌(Ⅰ期)检测方面，特异性为90.57%，敏感性为85.37%，明显优于传统CA125检测(P<0.05)。5.双盲实验进一步证实多重巢式甲基化特异性PCR检测早期上皮性卵巢癌的灵敏性为83.33%，特异性为82.76%。结论1.血清游离DNA甲基化可以准确反映肿瘤组织DNA甲基化状态，可以作为肿瘤早期诊断的标记物。2.本研究所开发的血清游离DNA多重巢式甲基化特异性PCR是高效准确检测血清游离DNA甲基化状态的新方法。3.多重巢式甲基化特异性PCR检测方法有望应用于上皮性卵巢癌的早期诊断。；子宫平滑肌肉瘤；不典型性平滑肌瘤；MicroRAN表达谱；DNA甲基化；

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