TTF-1体外诱导肝癌HepG2细胞凋亡的作用及机制研究

【摘要】目的：研究珍珠梅提取物TTF-1通过线粒体途径体外抑制肝癌细胞的作用及分子机制,为肝癌的生物学治疗提供可能的分子靶点及抑制剂；同时为推动TTF-1作为中药提取物应用于临床治疗肝癌提供基础研究证据。材料与方法：体外培养肝癌]3epG2细胞,首先应用MTT法检测珍珠梅提取物TTF-1对HepG2细胞的抑制作用,并应用倒置显微镜及透射电子显微镜观察加药前后(Oh、48h)HepG2细胞的形态学变化；其次,利用流式细胞仪、ELISA.Hoechst33324染色法,检测TTF-1处理前后细胞的凋亡情况。并利用划痕、平板克隆形成等验证TTF-1处理前后HepG2细胞的增殖、迁移以及凋亡情况。此外,利用Westernblotting方法、细胞免疫化学染色、免疫荧光法检测TTF-1处理前后bax、bcl-2、cyt-c、caspase3,9等线粒体途径相关蛋白的表达情况及定位情况。利用转染及双荧光素酶报告基因系统检测TTF-1对转录因子NF-κB转录活性的影响。结果：1.TTF-1在体外抑制肝癌HepG2细胞。倒置显微镜观察发现,未经处理的HepG2细胞体外生长连接紧密,有明显的极性；而应用TTF-1处理组的HepG2细胞呈扁梭形、细胞间连接松散。透射电镜观察可发现TTF-1处理组肝癌细胞出现核固缩碎裂及凋亡小体。2.TTF-1可抑制HepG2细胞的增殖与迁移。MTT检测结果表明,TTF-1可浓度依赖性地抑制HepG2细胞的体外增殖,50μmol/lTTF-1处理组48小时可体外杀伤约50%的HepG2细胞；平板克隆实验也证明：随着TTF-1药物处理浓度的升高,HepG2细胞体外克隆形成率逐渐降低。划痕实验结果表明：与未给药的对照组相比,TTF-1药物处理24h后,HepG2细胞的迁移能力明显受到抑制。3.TTF-1可诱导HepG2细胞凋亡。流式细胞仪检测结果表明：PE-Annexin-V/PI染色后,经TTF-1处理的HepG2细胞凋亡比例升高。此外,Hoechst33342染色可以看出,未经药物处理的细胞,核膜完整,细胞核呈蓝色。而经TTF-1药物处理48h后,细胞核呈亮蓝色、碎片状边集呈分叶状。4.TTF-1体外诱导凋亡的分子机制。Westernblotting结果显示,经TTF-1处理后,肝癌HepG2细胞中bax、bcl-2、cyc-c、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达发生变化。说明TTF-1可通过bax、bcl-2、cyc-c、Caspase-3、Caspase-9等线粒体途径相关蛋白体外诱导HepG2细胞的凋亡。TTF-1还可以通过抑制转录因子NF-κB的转录活性诱导凋亡。结论：1.TTF-1抑制通过诱导HepG2细胞凋亡抑制其体外增殖、迁移；2.TTF-1通过bax、bcl-2、cyc-c、Caspase-3、Caspase-9等线粒体途径相关蛋白体外诱导HepG2细胞的凋亡。3.TTF-1还可以通过抑制转录因子NF-κB的转录活性诱导肝癌细胞凋亡。
【作者】李妍；
【导师】崔逢德；
【作者基本信息】延边大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】肝癌；TT-1；凋亡；

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