胃泌素、曲妥珠单抗通过上调CCKBR表达协同抑制胃癌细胞增殖机制的研究

【摘要】目的观察胃泌素、曲妥珠单抗对胃癌细胞的协同增殖抑制作用,并研究胃泌素受体(CholecystokininBreceptor,CCKBR)及其下游分子信号通路在协同抗肿瘤作用中的分子生物学机制。方法：1.在NCI-N87、SGC7901两种胃癌细胞株中,通过细胞计数及克隆形成实验观察胃泌素、曲妥珠单抗对HER2阳性及HER2阴性胃癌细胞株的协同抗肿瘤作用,并通过流式细胞术观察二者对细胞周期的调控作用。2.在SGC7901细胞株中,予以胃泌素、曲妥珠单抗单药及联合用药处理后提取蛋白Western-blot检测CCKBR、AE1、AE2、P16、CyclinD1、β-catenin等相关蛋白表达水平改变,并通过核浆分离实验观察p16蛋白在细胞浆、细胞核中的定位改变,研究CCKBR,及其下游分子信号通路在协同抑制胃癌细胞增殖中所起的作用。3.Western-blot检测胃泌素、曲妥珠单抗对SGC7901、NCI-N87细胞中CCKBR蛋白表达的影响:通过Realtime-PCR了解二者对CCKBR蛋白表达调控的机制,并通过CHX、MG132实验验证二者对CCKBR蛋自稳定性及泛素化水平的影响并阐明其协同上调CCKBR的分子生物学机制。在SGC7901中转染pEGFP-CCKBR带GFP标签的XKBR过表达载体,进一步观察二者对CCKBR的膜定位的影响。4.通过建立裸鼠成瘤在体模型观察胃泌素、曲妥珠单抗的协同抗肿瘤作用,绘制肿瘤生长曲线；并取裸鼠荷瘤组织开展免疫组织化学染色分析,观察CCKBR的表达及膜定位的影响,提取蛋白后Western-blot检测AE1、AE2、P16、CyclisD1等蛋白表达改变,在体研究胃泌素、曲妥珠单抗通过上调CCKBR抑制胃癌细胞增殖的分子生物学机制。结果：1.7种胃癌细胞株及永生化的正常的人类胃粘膜上皮细胞株GES-1中只有NCI-N87表达HER2蛋白,而CCKBR在大部分胃癌细胞株中均表达阳性。2.曲妥珠单抗对HER2阳性的NCI-N87细胞有明显增殖抑制作用,对HER2阴性的SGC7901细胞无效。胃泌素对SGC7901、NCI-N87细胞均有增殖抑制作甩,细胞计数及克隆形成实验证实在NC1-N87、SGC7901细胞中,胃泌素、曲妥珠单抗联合用药与单药组相比有明显协同肿瘤增殖抑制作用。流式细胞术提示胃泌素、曲妥珠单抗可协同阻滞SGC7901细胞于G0/G1期。3.胃泌素、曲妥珠单抗可协同上调CCKBR蛋白,Real-timePCR结果证实胃泌素、曲妥珠单抗不影响SGC7901细胞CCKBRmRNA水平,但CHX、MG132实验结果显示胃泌素、曲妥珠单抗可协同增加CCKBR蛋白的稳定性并降低CCKBR蛋白的泛素化水平。4.Western-blot证实胃泌素、曲妥珠单抗可协同下调SGC7901细胞中p16、AE1、CyclinD1、β-catenin蛋白表达,上调AE2蛋白,降低胞浆内p16蛋白并促进其入核。5.裸鼠荷瘤实验显示胃泌素、曲妥珠单抗在体内亦有协同抗肿瘤作用,荷瘤免疫组织化学染色显示联合用药组细胞膜CCKBR蛋白表达较单药组明显增多,荷瘤组织提取蛋白做Western-blot示胃泌素、曲妥珠单抗在体内亦协同下调p16、AE1、CyclinDl蛋白、上调AE2蛋白,与体外实验结果一致。结论：1.胃泌素、曲妥珠单抗的体内、体外实验均证实对胃癌有协同抗肿瘤作用,并首次发现曲妥珠单抗在HER2阴性的胃癌细胞中同样具有协同抑癌作用。2.胃泌素、曲妥珠单抗协同上调CCKBR蛋白表达并促进其膜定位,上调的CCKBR与胃泌素相结合启动并放大对下游信号分子的影响可能是胃泌素与曲妥珠单抗协同抗肿瘤增殖的关键环节。3.上调的CCKBR与胃泌素结合后可影响AE1/p16/AE2复合体,使胞浆内p16减少、入核增加,AE1下调,AE2上调,细胞酸化,Wnt/β-catenin通路失活,CyclnD1下降,最终阻滞细胞于G1期从而抑制肿瘤细胞增殖。
【作者】崔演；
【导师】吴龙仁；傅国辉；
【作者基本信息】延边大学，内科学，2014，博士
【关键词】胃泌素；曲妥珠单抗；胃癌；CCKBRAE1/p16/AE2；

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