重组人血管内皮抑素治疗恶性浆膜腔积液的基础与临床应用研究

【摘要】目的：观察、探究重组人血管内皮抑素(rh-Endostatin,商品名称：恩度,英文名称：Endostar,研发代号：YH-16)治疗恶性浆膜腔积液的作用机制,评价Endostar浆膜腔内灌注治疗恶性浆膜腔积液的临床疗效和应用安全性。方法：本实验研究选择BALB/C小鼠,采用H22肝癌腹水瘤细胞株腹腔内注射建立H22腹水瘤实验模型。(1)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用的实验Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用的实验动物分组：180只小鼠随机分为6组,每组30只,Ⅰ组：阴性对照组(0.9%氯化钠,0.2ml)；Ⅱ组：阳性对照组(顺铂1mg/kg);Ⅲ组：低剂量治疗组(Endostar5mg/kg);Ⅳ组：中剂量治疗组(Endostar10mg/kg);Ⅴ组：高剂量治疗组(Endostar15mg/kg);Ⅵ组：联合治疗组(顺铂lmg/kg+中剂量Endostar10mg/kg)。腹腔内隔日注射用药,共3次,每次给药前处死6只。观察小鼠一般情况,记录小鼠体重变化,存活状况,计算存活率,绘制生存曲线,收集腹水及血液,酶联免疫吸附法(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)检测血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的浓度。(2)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形态研究60只小鼠分6组,每组10只。分组同实验(1)。小鼠腹腔积液长出后经超声检查确认,各组均隔日腹腔药物注射,调整药物浓度,总共给药3次。停药1天后处死小鼠。腹膜标本光镜HE染色,观察腹膜血管及细胞形态学变化。比较生理盐水、顺铂及中剂量Endostar组腹膜微血管密度。电镜观察腹膜形态学变化。(3)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子检测40只小鼠分2组,中剂量连续给药组(连续组)和中剂量隔2日给药组(隔2日组)各20只；实验采用中剂量组10.00mg/kg给药,连续组d7,d8,d9,d10,d11,d12给药,隔2日组分别于d7,d10给药。均在d7,d13处死小鼠各10只。采用ELISA法和SP法分别检测腹水、腹膜组织中VEGF、基质金属蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinases,MMP-2)、MMP-9、缺氧诱导因子-1α(Hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)、存活素(Survivin)、Caspase-3、Caspase-9、B细胞淋巴瘤／白血病-2基因(B-celllymphoma/leukemia-2,Bcl-2)和Bcl-xl的表达。(4)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管机制研究78只小鼠共分为4组,中剂量给药,连续组(2a)：d7,d8,d9,d10,d11,d12；隔日组(2b)：d7,d9,d11；隔2日组(2c)：d7,d10；每周组(2d)：d7；连续组、隔日组分别于d7,d9,d11,d13处死小鼠每组6只,隔2日组于d7,d10,d13；每周组于d7,d13处死小鼠。对实验腹膜组织分别进行Real-TimePCR检测MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA,蛋白印迹法(Westernblot)检测腹膜蛋白表达水平。(5)Endostar对恶性浆膜腔积液患者的区域灌注治疗的临床观察晚期恶性肿瘤合并浆膜腔积液的患者共60例,随机分组,分为Endostar腔内单药灌注治疗组(单药组)31例,Endostar与顺铂联合局部灌注治疗组(联合组)29例。超声定位,“猪尾巴”导管积液腔内穿刺导管留置术,尽可能放尽积液,单药组由导管注AEndostar行局部区域灌注治疗。胸腔积液或心包腔积液患者,Endostar单次注入30mg；腹腔积液患者,Endostar单次注入45mg,隔日1次,连续使用1-2周时间,视积液情况,每周1～2次维持。联合治疗组在单药基础上联合加用顺铂化疗(联合组),顺铂剂量30-40mg/m2。RECIST1.1“不可测量病灶”疗效评价标准,计算临床获益率(Diseasecontrolrate,DCR),评价生活质量(Qualityoflife,QOL)以及NCICTC3.0版标准评价毒副反应。结果：(1)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠作用荷H22腹水瘤小鼠腹水出现前(第1-6天),小鼠进食、饮水、活动以及排便等一般情况均良好；接种后约第6-7天开始,生理盐水阴性对照组小鼠体重迅速增加；第9-10天开始,荷瘤小鼠逐渐出现精神萎靡、呆滞少动,活动迟缓、反应性差、食欲降低、粪便干燥等,腹水增长速度高于各用药组；第11-12天开始,小鼠晚期呆滞少动,腹部极度膨隆,呈恶液质状态；第12天对照组小鼠全部死亡；Endostar与顺铂联合组体重增加较慢,精神较好,中位生存期为17天。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水的抑制作用显示：实验第9天,Endostar各剂量组及Ⅱ组较Ⅰ组出现的腹水量减少,荷瘤小鼠体重差异有统计学意义(p<0.05),但是Endostar各剂量组较Ⅱ组无统计学差异(p>0.05)；第11天,EEndostar各剂量组较Ⅰ组、Ⅱ组荷瘤小鼠有统计学意义(p<0.05)；Endostar各剂量组间比较Ⅳ组较Ⅲ、Ⅴ组荷瘤小鼠体重差异有统计学意义(p<0.05)；第13天,各组荷瘤小鼠的体重均发生了显著的变化,组间比较均有统计学意义(p<0.05)；第9天、第11天、第13天Ⅵ组较Ⅰ组出现的腹水量少,荷瘤小鼠体重差异有统计学差异(p<0.05)；较Ⅱ组有统计学差异(p<0.05)；较Endostar各剂量组荷瘤小鼠体重差异有统计学意义(p<0.05)。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠生存时间的影响显示：Ⅰ组中位生存时间为10.54±0.32天,时间最短；Ⅵ组最长,为17.01±0.31天,Endostar不同剂量组荷瘤小鼠的生存时间较对照组延长,差异显著(p<0.05)；Endostar各剂量组间比较Ⅳ组较Ⅲ组生存时间差异有统计学意义(p<0.05)；Ⅵ组较Ⅰ组、Ⅱ组、及Endostar各剂量组生存时间延长(p<0.05)。Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹水及血清中VEGF表达的影响：实验第9天Endostar各剂量组腹水及血清中的VEGF较Ⅰ组有统计意义(P<0.05);Endostar各剂量组间比较Ⅳ组腹水、血清中VEGF数值较Ⅲ、Ⅴ组差异有统计学意义(p<0.05)；第11天各组间比较荷瘤小鼠腹水中VEGF数值下降明显,均具有统计学意义(p<0.05)；荷瘤小鼠血清中VEGF表达,在Ⅳ组、Ⅴ组较Ⅱ组比较有统计学意义(p<0.05)；Endostar各剂量组间比较血清VEGF数值有统计学意义(p<0.05)；第9天、第11天Ⅵ组腹水及血清中VEGF表达较Ⅰ组、Ⅱ组、Endostar各剂量组下降均有统计学意义(p<0.05)。(2)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管形态学的影响观察各组荷瘤小鼠腹膜和腹腔脏器表面未见有明显的种植转移瘤、转移结节形成；腹膜光镜检查各用药组腹膜血管及细胞形态未见明显差异,用药组未见大片细胞坏死及间质血管减少现象。腹膜微血管密度(Microvesseldensity,MVD)检测中剂量Endostar组为13.96±0.59,与顺铂组14.24±0.40及生理盐水对照组14.36±0.57比较,其MVD绝对数值稍有降低,但无统计学差异(p>0.05)。腹膜的电镜观察显示,生理盐水组腹膜毛细血管的通透性明显增强,毛细血管完全由单层血管内皮细胞连接而形成,细胞基底膜结构破坏,毛细血管壁极薄,细胞之间连接较疏松,并可见大量线粒体水肿、空泡化现象；3个不同剂量的Endostar组可见腹膜毛细血管壁增厚,部分趋于正常；细胞间紧密连接,缝隙连接较多；线粒体水肿明显减轻,并可见较多正常线粒体。提示Endostar可以减轻微血管损伤,使之趋于正常化。顺铂组小鼠腹膜毛细血管壁较薄,细胞基底膜损伤较重；细胞之间连接较疏松以及因小鼠生存时间延长导致线粒体出现代偿最终转化为线粒体水肿数量明显增多的现象；联合治疗组腹膜毛细血管壁明显增厚；细胞之间连接紧密以及线粒体基本正常等血管正常化改变。(3)Endostar对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管生物因子检测结果荷瘤鼠恶性腹腔积液中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等8个指标在药物干预前水平明显高于治疗后,经过Endostar干预治疗后,各指标出现明显的下降,Endostar可以明显下调上述8个生物因子在腹腔积液中的表达水平。在治疗方式比较上,隔2日给药组腹水中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2表达水平下降的幅度更低,组间比较具有统计学意义(p<0.05)。在对腹膜组织的组化染色比较上,也出现了与腹水ELISA检测相似的研究结果。(4)Endosta对荷H22腹水瘤小鼠腹膜微血管机制中剂量Endostar采用不同给药时间方式对荷瘤小鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA水平检测以及蛋白表达水平的研究。Endostar采用连续给药、隔日给药、隔2给药和每周给药对荷瘤小鼠腹膜组织中MMP-2mRNA、VEGFmRNA和SurvivinmRNA的相对表达的影响显示,其相对表达明显下降,并具有统计学差异(p<0.05)。提示Endostar可以显著的下调荷瘤鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的mRNA表达,分析比较中剂量Endostar应用各组的抑制、下调水平,提示隔2日组给药对MMP-2mRNA、VEGFmRNA和SurvivinmRNA的相对表达量的下调作用效果最优,分别显著强于连续、每周及隔日给药组,差异显著(p<0.05)。提示,隔2日给药组治疗效果最佳。此研究趋势在MMP-2、VEGF和Survivin蛋白表达的研究中其总体趋势相近,但Endostar连续给药组对MMP-2、VEGF和Survivin的蛋白下调效应明显优于隔日给药、隔2日以及每周给药组,具有统计学意义(p<0.05),提示连续给药方式具有较大的治疗优势和治疗效应；中剂量Endostar隔日、隔2日给药作用效应相近,未见组间差异(p>0.05),但两组的作用效应均优于每周给药治疗组,具有统计学差异(p<0.05)。(5)Endostai对恶性浆膜腔积液患者的区域灌注治疗的临床观察全组平均完成2.27个治疗周期,平均治疗持续时间为56.7天。患者治疗顺利,耐受性满意,未见有因为药物性不良反应而退出临床治疗患者。患者近期疗效：CR：10.00%,NCR/NPD:58.33%,PD：31.67%,DCR：68.33%,亚组分析,单药组合联合组各指标分别为：6.45%、54.84%、38.71%、61.29%和19.77%、62.07%、24.14%、75.86%,其联合组CR、NCR/NPD和DCR等指标绝对值均明显优于单药组,但两组间无统计学差异(p>0.05)。全组患者治疗后QOL均有不同程度的改善,单药治疗组QOL改善者17例,占54.84%；QOL稳定者8例,占25.80%；QOL降低者6例,占19.35%。联合化疗组各指标对应为18例,占62.07%；6例,占20.69%；5例,占17.24%。组间比较未见明显差异(p>0.05)。患者治疗中出现的Ⅲ+Ⅳ度毒副反应主要出现在联合治疗组患者中,单药组未见发生。结论：(1)Endostar具有抑制小鼠恶性腹腔积液的生成和延长荷瘤小鼠生存期的作用,中剂量组较其他单药剂量组显示较好的效果,Endostar和顺铂联合应用具有明显的协同作用；(2)Endostar通过下调荷瘤小鼠腹腔积液中VEGF的产生和表达阻断血管生成,抑制恶性腹腔积液的形成,此效应在Endostar中剂量应用组中表现更优,并可能与顺铂联合应用具有明显的协同作用。(3)Endostar具有降低荷瘤鼠腹膜微血管密度绝对值的效应,改善腹腔积液腹膜微血管超微结构的效应,降低膜血管通透性,修复细胞基底膜的损害结构,细胞间连接紧密,改善线粒体水肿、空泡化状态,引发线粒体代偿性增多,促进血管正常化。此效应在Endostar与顺铂联合给药中更加明显。(4)Endostar可能通过降低腹腔积液及腹膜组织中VEGF、MMP-2、MMP-9、Survivin、Caspase-3、Caspase-9、HIF-1α和Bcl-2等肿瘤相关因子的表达,降低血管通透性,保持基底膜完整性,诱导肿瘤细胞凋亡,改善肿瘤缺氧微环境,抑制恶性浆膜腔积液的生成。此效应与不同给药方法之间具有一定的差异。(5)Endostar可以显著的降低荷瘤鼠腹膜组织中MMP-2、VEGF和Survivin的αRNA表达水平以及蛋白表达水平。Endostar治疗恶性浆膜腔积液的产生是一个多因素综合作用的结果。Endostar采用间断给药优于连续给药模式。(6)采用Endostr浆膜腔局部灌注可以较好的改善恶性肿瘤患者浆膜腔积液的近期治疗效果,患者耐受性满意,并具有较好的临床安全性,Endostar联合化疗药物腔内灌注可能具有潜在的协同作用效果。
【作者】高文斌；
【导师】方今女；
【作者基本信息】延边大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】重组人血管内皮抑制素；浆膜腔积液；恶性肿瘤；治疗；机制；

【参考文献】
[1]梁勤欧,祝国瑞.人工免疫系统及其在空间信息系统中的应用[J].测绘通报,2002,12:13-16.
[2]唐锋.银行个人识别码的加密、传输与验证的研究与实现[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[3]申卫军,彭少麟,邬建国,林永标.南亚热带鹤山主要人工林生态系统C、N累积及分配格局的模拟研究[J].植物生态学报,2003,05:690-699.
[4]王珊.我国网上银行业务安全的法律保障机制研究[D].浙江工商大学,经济法学,2012,硕士.
[5]王莹莹.我国产业政策走向法律问题研究[D].华中师范大学,经济法学,2013,硕士.
[6]马其贞.基于制动意图识别的制动能量回收控制算法研究[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[7]彭钧敏,王佳楠,叶旭东.不确定型网络系统的分布式自适应跟踪控制器(英文)[J].自动化学报,2013,10:1729-1735.
[8]杨红.滇池蓝藻沼气发酵及其降解藻毒素的实验研究[D].云南师范大学,农业生物环境与能源工程,2013,硕士.
[9]杨根科,吴智铭,陈赟.减链约束多处理器任务在三处理器中的调度[J].自动化学报,2004,04:583-587.
[10]孙明军,杨建林.竞争情报工具现状分析[J].情报杂志,2004,12:119-121.
[11]郭鹏.往复式压缩机工作过程模拟计算及试验研究[D].河南科技大学,工程热物理,2014,硕士.
[12]周克继.卡拉拉国际2000年石材展观感[J].石材.2000(08)
[13]张志明.源271区块超前注水方案优化及配套措施组合研究[D].东北石油大学,油气田开发工程,2013,硕士.
[14]彭瑶.金融消费者替代性纠纷解决机制研究[D].华中师范大学,民商法学,2013,硕士.
[15]蔡丹.促进基本公共服务均等化的财政体制改革研究[D].山东财经大学,国民经济学,2012,硕士.
[16]阎金龙.玉米秸秆的高值化应用[D].齐鲁工业大学,化学工程,2013,硕士.
[17]管晨.穿心莲内酯磺化物治疗EV71型乳鼠动物模型研究实验[D].北京中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[18]孙国强,屠越,孙永辉,卫志农,徐泰山,王胜明.时变时滞电力系统鲁棒稳定性的改进型判据[J].电力系统自动化,2015,03:59-62.
[19]杨阳.三种结构材齿板连接对比试验研究与力学模型构建[D].北京林业大学,结构工程,2013,硕士.
[20]高珊.“A的A，B的B”格式考察[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[21]温滨.机载数字化罗盘控制盒的设计与实现[D].电子科技大学,电子与通信工程（专业学位）,2012,硕士.
[22]贺超.两种不同气道管理方法的全麻异体肾移植术术后并发症的比较[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[23]武超.我国房地产上市公司公司治理对公司绩效的影响研究[D].山东建筑大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[24]刘子赫.基于GPU的网络流量特征提取并行算法设计与实现[D].内蒙古大学,计算机科学与技术,2014,硕士.
[25]库尔班艾提.经PVP包覆ZnO纳米颗粒对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响研究[D].东北师范大学,凝聚态物理学,2012,硕士.
[26]丁红蕾,郭瑞堂,张军,段圣青,郑成航,潘卫国,高翔.微观结构特性对石灰石脱硫活性的影响[J].电站系统工程,2014,02:23-24+27.
[27]夏丰滨.汽车用7000系铝合金激光焊接接头组织与性能研究[D].北京有色金属研究总院,材料科学与工程,2013,硕士.
[28]段开锋.电池储能系统在配电网中的应用研究[D].北京交通大学,2014.
[29]戴柏.连接蛋白40、43基因表达水平对绒山羊毛囊生长发育相关基因表达的影响[D].内蒙古大学,动物学,2014,硕士.
[30]李彝利.西藏飞蝗触角感受器及其聚集信息素研究[D].四川农业大学,农业昆虫与害虫防治,2012,硕士.
[31]邹久礼.自主挖掘机器人轨迹规划研究与控制系统设计[D].太原科技大学,机械电子工程,2014,硕士.
[32]张日东,王树青.一类非线性系统的自适应预测函数控制[J].控制与决策,2007,06:711-715.
[33]王灵军.节能型盘式污泥干燥设备控制系统的开发[D].杭州电子科技大学,机械工程,2012,硕士.
[34]巨浩波,吕生华,孙婷,孔宪辉.石墨烯和硅丙乳液复合材料的制备及性能[J].高分子材料科学与工程,2014,08:144-149.
[35]孙万鹏.STATCOM在风电并网系统电压稳定性中的应用研究[D].南京邮电大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[36]吴茁.轿车车身部件点焊机器人工作站人机工程仿真分析[D].吉林大学,材料工程,2014,硕士.
[37]刘晓玲.基于半监督学习方法的情感分析研究[D].天津财经大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[38]王兵.矿山多功能检测仪及数据无线传输的研究[D].鲁东大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[39]郭学增.录井信息集成技术应用前景初议[J].录井工程,2004,04:9-14+82.
[40]张阳.乌梁素海萘降解细菌的分离、鉴定与降解特性的研究[D].内蒙古农业大学,微生物学,2012,硕士.
[41]关春玲,刘鸿彬.藏族传统生态文化研究综述[J].黑河学院学报,2015,01:112-115.
[42]冯莎.基于空间聚类的基本农田保护规划[D].湖北大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[43]靖静.河北省户外旅游开发研究[D].河北师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[44]唐亮.基于复杂背景的车牌识别系统算法研究[D].东北师范大学,电路与系统,2012,硕士.
[45]张云鹏.《五号屠场》中黑色幽默的认知研究[D].南昌航空大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[46]钟春仿.结构突变理论及其对上证指数的实证[D].东北财经大学,数量经济学,2003,硕士.
[47]林翔.北京市房地产业经济地位的实证分析[D].北京交通大学,统计学,2012,硕士.
[48]李长东.添加钨、钽元素对镍基自熔性合金等离子堆焊涂层组织与性能影响的研究[D].兰州理工大学,材料工程,2014,硕士.
[49]于婉婷.聚间苯二胺的化学氧化合成及其除铬（Ⅵ）研究[D].中南大学,冶金环境工程,2013,博士.
[50]张博.档案馆档案信息服务模式研究[D].安徽大学,档案学,2014,硕士.