清营汤及其拆方改善营分证血瘀病理变化的相关机理的实验研究

【摘要】目的：本研究通过采用荧光定量PCR的方法测定温病营分证动物模型家兔细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、诱生型一氧化氮合酶(INOS)量，进一步从更加微观的角度验证营分证中兼夹血瘀的病理变化。同时根据药物的主要功效对清营汤进行拆方研究,分别拆方为以养阴透热为主要功效及凉血散瘀为主要功效的药物组,拟通过拆方研究对清营汤改善营分证血瘀病理变化的机理做进一步深化的探究。同时反证营分证血瘀病变的致病机制,并且从初步探讨清营汤及其拆方对营分证血瘀病理改变的作用及其作用机制。方法：将50只新西兰家兔,随机分为以下五组：正常对照组(A组)、模型组(B组)、中药1组(清营汤组)(C组)、中药2组(凉血散瘀组)(D组)、中药3组(养阴透热组)(E组),每组各10只。除对照组以外的各组均以地塞米松每日2.5mg/kg后肢肌肉注射,对照组以等量生理盐水进行肌肉注射,连续用药7日。第3日起,各实验组动物分别以相应中药等效剂量5倍的药物进行灌胃,每日药量分两次(早、晚)灌胃,对照组和模型则灌以同量的生理盐水代替,连续灌胃5天。第7日晚进行喂饲后各组皆禁食禁水。第8日模型组和各实验组皆以2.5ml/kg速尿进行后肢肌肉注射,2小时后经耳缘静脉缓缓注入内毒素5ug/kg。在注射LPS前及其后1、2、3、4、5小时各测定肛温一次,并绘制平均体温的反应曲线,统计模型动物发热高峰净增值(At)及5小时发热指数(TRI5)的变化。观察5小时后采血及脏器组织标本,分别测定各组家兔的血流变、血清ICAM-1、血清VCAM-1、血清iNOS的含量,并采用荧光定量PCR的方法测定各组家兔血管内膜细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达量,取肝组织、肺组织进行HE染色,并通过与模型组的对比研究,观察清营汤及其拆方对营分证血瘀病理改变的作用及其作用机制。结果：1.在体温方面：与正常组相比,营分证模型组的发热净增值与5小时发热指数均明显升高,统计学有显著性差异(P<0.01)。经过中药治疗后,中药1组、中药2组、中药3组的发热净增值与5小时发热指数均显著降低,与模型组相比较,有显著性差异(P<0.01,P<0.05),而其中中药1组降低家兔营分证体温的作用最明显。中药3组接近中药1组,统计学无显著性差异(P>0.05)。中药2组与中药1组、中药3组比较统计学有显著性差异(P<0.01),说明中药1组、中药3组均有明显的降体温效果,而中药2组在降体温方面的作用不及中药1、3组。2.在血流变方面：营分证模型组的全血粘度、还原粘度、血浆粘度、红细胞压积等血流变相关指标均较正常组有明显提高,统计学有显著性差异(P<0.01)。从血流变角度充分说明营分证模型动物有明显的血液高黏、高聚的血瘀改变。同时证实营分证模型的成功建立,其中清营汤组、凉血散瘀组、养阴透热组对营分证动物模型血流变各项指标均有不同程度的改善,其中尤以清营汤改善作用最为明显。在全血还原粘度(高、中、低)切变率、血浆粘度方面、红细胞聚集指数方面清营汤组与正常组相比统计学无显著性差异(P>0.05),而凉血散瘀方组的还原粘度低切变率、红细胞压积值接近清营汤组(P>0.05)养阴透热组对全血粘度(中、低)切变率及还原粘度(高、中、低)切变率作用与凉血散瘀组相当,其余指标与清营汤、活血散瘀相比均有显著差异(P<0.01或P<0.05)。表明清营汤及拆方2组均能够不同程度上改善营分证血瘀的病理变化。但其中以清营汤、凉血散瘀方改善较明显。3.在血清ICAM-1、VCAM-1、INOS方面：营分证模型组的含量水平均较正常组显著升高,统计学有显著性差异(P<0.01)；药物治疗后,中药1组、中药2组、中药3组对营分证模型动物血清ICAM-1、VCAM-1、INOS方面均有不同程度的降低作用,与模型组相比,统计学均有显著性差异(P<0.01,P<0.05)；其中中药1组的血清ICAM-1含量水平、血清VCAM-1含量水平与正常组相比较统计学无显著性差异(P>0.05),中药2组血清VCAM-1含量水平与正常组相比较均无明显差异(P>0.05),结论：清营汤、凉血散瘀方、养阴透热方均能降低营分证动物模型的血清ICAM-1、VCAM-1、INOS含量水平,而其中以清营汤、凉血散瘀方改善作用最为明显。4.在血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS表达方面：营分证模型组的表达水平均较正常组显著升高,统计学有显著性差异(P<0.01)；3个中药治疗组对营分证模型动物血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS表达水平均有明显的降低作用,与模型组相比较统计学有显著性差异(P<0.01,P<0.05),并且中药1组的血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS表达水平接近正常组,中药2组在VCAM-1、INOS表达水平与中药3组接近,统计学均无显著性差异(P>0.05),结论：清营汤、凉血散瘀方、养阴透热方均能明显降低营分证动物模型的血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS表达水平,而其中以清营汤改善作用最为明显,养阴透热与凉血散瘀作用相当。结论：1.温病营分证家兔动物模型的体温,血流变学各项指标,血清ICAM-1、VCAM-1、INOS含量均较正常组有明显的增高,血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS表达水平均显著升高。一方面证实营分证动物模型的成功建立,同时从更加微观的角度说明营分证兼有血瘀的病理变化。2.清营汤全方能改善营分证动物模型的症状,明显降低动物模型的体温,降低营分证模型血流变各项指标,降低营分证血瘀病理模型的血清ICAM-1、VCAM-1、INOS含量及血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS的表达水平,最终达到改善营分证血瘀病理变化的作用。3.养阴透热方和凉血散瘀方两拆方组均能改善营分证动物模型的症状,不同程度的降低动物模型的体温,在不同程度上改善营分证模型血流变性以及血清ICAM-1、VCAM-1、INOS含量及血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS的表达水平,最终达到改善营分证血瘀病理变化的作用。这一结果反证了营分证血瘀形成的两大主要因素营热炽盛和营阴耗损,在本质上乃因热致瘀,瘀热互结,这和古籍中所记载得“血受热则煎熬成块”以及“津液被火灼竭,则血行愈滞”是一致的,所以对于营分证血瘀病理变化的治疗不能单纯注重凉血化瘀,还应该要重视养阴透热药物的运用。4.拆方中以养阴透热为主要作用的药物组较凉血散瘀为主要作用的药物组在降体温方面有比较明显的优势,而血瘀相关指标的改善方面凉血散瘀组相比养阴透热组有一定的优势。但拆方组分的养阴透热药和凉血散瘀药的总体效果均不及清营汤全方,这一结果反映出清营汤中的养阴透热药物与凉血散瘀药物各有专攻、各有所长,但两方面药物的作用却是相辅相成、不可分割的。其中清营汤全方的整体协同作用明显优于任一拆方。清营汤全方作用并非是单纯的养阴透热药物和凉血散瘀药物功能的简单相加,单纯药物组均难以实现治疗的最佳效果,养阴透热与凉血散瘀两法既不能取代全方,也不能相互替代,两法合用具有治疗上的协同、制约与优化增效作用。由此揭示出清营汤组方配伍的合理性、科学性与必要性,同时也证明了中药方剂不同于中药化学成分分析,不是药物功能的简单相加,而是针对具体病证的病因病机而设,方从法出,以法统方,形成理、法、方、药的有机统一体。5.清营汤改善营分证血瘀病理变化的作用机制可能是通过抑制血管内膜ICAM-1、VCAM-1、INOS的表达水平从而降低血清中ICAM-1、VCAM-1、INOS含量,达到改善动物。模型所表现出得稠、黏、聚的血流变异常,从而疏通络道,保证气血流通,改善营分证血瘀病理变化。这也可能是清营汤先证用药,截断病势,最终阻止温邪向脏腑深入而发展到血分证阶段病变程度的作用机制之一。
【作者】戴丽莉；
【导师】林培政；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医临床基础，2014，博士
【关键词】清营汤；营分证；血瘀；血流变；血管内皮细胞；ICAM-1；VCAM-1；INOS；

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