EGCG对痴呆模型小鼠学习记忆能力的作用及其机制研究

【摘要】目的：通过观察绿茶主要成分EGCG作用于老年性痴呆模型小鼠SAMP8后,其行为学特征的变化,探讨EGCG对痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响,并进一步探讨其可能的作用机制,为AD的研究提供参考思路。方法：一、体内实验1.Morris水迷宫实验：选择4月龄SPF级雄性快速衰老亚系8(SAMP8)小鼠24只,随机分为模型组、EGCG低剂量组、EGCG高剂量组。使用同月龄抗快速衰老亚系1(SAMR1)小鼠8只作为阴性对照组。EGCG低、高剂量组给药剂量分别为5mg/kg·d,15mg/kg·d,阴性对照组和模型组以0.9%生理盐水灌胃,每日1次,给要共60天。给药结束后,采用Morris水迷宫等行为学方法检测动物的学习记忆能力。2.分子生物学实验：采用Westernblot和ELISA法检测小鼠脑皮质内Aβ42的表达,采用Westernblot法检测小鼠脑皮质内APP、NEP、Bcl-2、Bax等蛋白表达情况。3.免疫学实验：采用免疫荧光染色法对小鼠脑石蜡切片进行尼氏小体染色,观察神经元损伤情况。二、体外实验：1.用Westernblot法检测EGCG作用于M146L细胞后,细胞中NEP、APP、Aβ42、Bax、Bcl-2等蛋白表达的影响。2.ELISA法检测EGCG作用于M146L细胞后,细胞外Aβ42的表达情况。3.用基因沉默法对M146L细胞进行NEP的敲除,分析NEP沉默后EGCG对Aβ42降解的作用,检测NEP基因沉默后Aβ42的表达,进一步佐证NEP是EGCG调控Aβ42的关键因素。4.用MTT法检测NEP基因沉默前、后EGCG对M146L细胞活性的影响。结果：一、体内实验：1.采用EGCG对痴呆小鼠进行灌胃60天后,高剂量EGCG组(15mg/kg·d)对痴呆小鼠学习记忆能力有明显改善作用。在定位航行试验中,EGCG高剂量组逃避潜伏期与模型组相比时间缩短,有统计学意义(p<0.01),游泳路程与模型组相比没有显著差异(p>0.05)。在空间探索试验中,小鼠跨平台次数在各组间没有明显差异(P>0.05),其在目标象限停留时间比模型组显著增加(p<0.01)。而EGCG低剂量组(5mg/kg·d)则对其学习记忆能力没有明显改善作用(p>0.05)。2.模型组SAMP8小鼠与阴性对照组SAMR1小鼠相比较,脑皮质Aβ42的表达量明显增多(p<0.05),EGCG低剂量组Aβ42的表达(WB及ELISA法)比模型组明显减少(p<0.01,p<0.05),EGCG高剂量组Aβ42的表达量比模型组明显减少,具有统计学意义(p<0.01,p<0.01)。EGCG治疗组较模型组APP的相对表达量有降低趋势,但没有明显差异(p>0.05)。3.模型组与对照组小鼠相比较,脑皮质内NEP表达有所降低,但没有统计学差异(p>0.05),EGCG低剂量组和高剂量组NEP的表达和酶活性均较之模型组有显著增加(p<0.05)。4.模型组小鼠Bcl-2表达量比对照组显著降低(p<0.05),而Bax表达量明显增加(p<0.05)；EGCG高剂量组Bcl-2表达量较模型组显著增加(p<0.05),Bax表达显著降低(p<0.01)；EGCG低剂量组Bcl-2表达与模型组比较无差异(p>0.05),但是Bax表达显著降低(p<0.01)。5.各组小鼠脑组织制作石蜡切片进行尼氏染色后,可以在荧光显微镜下明显观察到模型组小鼠神经元数目减少、排列紊乱,神经元细胞开始核空泡变性,尼氏小体减少甚至消失,从形态学上观察,神经元损伤明显。而EGCG两个剂量组神经元损伤较模型组有所减轻。二、体外实验：1.EGCG高剂量组(32mmol/L)均能明显提高M146L细胞的活性(p<0.01),而低剂量组(16mmol/L)对其细胞活性没有显著影响(p>0.05)；EGCG高剂量组能显著减少M146L细胞内Aβ42及细胞外分泌的Aβ42的表达(p<0.05,p<0.01),EGCG低剂量组对细胞内Aβ42无显著影响(p>0.05),但是能显著降低细胞外Aβ42的表达量(p<0.05)。EGCG低剂量组及高剂量组细胞内APP的表达量均有显著降低(p<0.05,p<0.01)。2.进一步实验表明,用EGCG高剂量作用于M146L后,能够上调细胞内NEP的表达(p<0.01)及其酶活性(p<0.05),并且上调了Bcl-2的表达(p<0.01),EGCG低剂量组对NEP的表达与模型组没有显著差异(p>0.05),但是显著提高了细胞内Bcl-2的表达水平(p<0.05)而EGCG高剂量和低剂量组均没有明显下调细胞内Bax的表达量(p>0.05)。3.对M146L细胞进行NEP基因沉默后,EGCG不能发挥下调Aβ42的作用,与未进行NEP干扰的组别相比较,Aβ42的表达显著增高(p<0.05)。结论：1.以15mg/kg·d的剂量对4月龄SAMP8小鼠连续灌胃60天后,可以有效改善SAMP8小鼠学习认知和空间记忆能力。2.EGCG能够明显降低SAMP8小鼠脑组织及M146L细胞内Aβ42的表达,APP的表达在动物脑组织中有下调的趋势,但没有显著差异,然而在M146L细胞中表现出明显的下调作用。3.EGCG能够明显上调SAMP8小鼠脑组织及M146L细胞内Aβ42降解酶NEP的表达和酶活性水平,促进了Aβ42的降解。4.EGCG能够通过调节Bcl-2/Bax途径,增加Bcl-2表达,抑制Bax的表达水平,从而在一定程度上抑制神经元的凋亡。5.EGCG改善痴呆模型SAMP8小鼠的学习记忆能力的作用机制可能是通过上调Aβ降解酶NEP的表达及活性,增加了Aβ的降解,使得Aβ聚集减少,减轻了其对神经元的神经毒性作用,抑制了神经元的凋亡,从而发挥了神经保护作用,对AD的治疗研究上可能具有一定的价值和意义。
【作者】常翔；
【导师】王奇；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】阿尔兹海默病；β淀粉样蛋白；表没食子儿茶素没食子酸酯；中性内肽酶；

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