骨折术后舒筋活络熏洗法应用时机的实验及临床研究

【摘要】目的：舒筋活络熏洗法是骨科临床上应用较多的治疗方法,具有疏通经络、散瘀消肿的作用,能够促进肢体功能的恢复。但在临床实践中发现,部分骨折患者过早采用舒筋活络中药熏洗患处后,出现了局部皮肤发红、软组织肿胀、疼痛等症状,严重者甚至造成软组织的硬化及骨化,而推迟使用此法的患者则较少出现这些不良反应。为什么会出现这种不良反应?是否提示该不良反应的发生与中药熏洗的应用时机存在着相关性?那么何时应用中药熏洗才合适呢?本课题旨在采用组织学、分子生物学技术,在损伤症候指数、组织病理学、细胞因子等方面,探讨舒筋活络熏洗损伤软组织后出现不良反应的原因及其发生机制；在不同时间点应用舒筋洗药熏洗干预后,酶联免疫分析法检测(ELISA)血清中IL-1β、IL-6的含量,免疫组化、RT-PCR及Western-blot等方法相结合检测损伤软组织中PDGF、TGF-β的蛋白表达变化,为研究适时合理应用中药熏洗干预提供理论基础；临床研究以涉及肘关节的骨折为代表,在不同时间点运用舒筋洗药熏洗进行干预,从疼痛、肿胀程度、肘关节ROM、皮肤反应情况、安全性及Mayo肘关节功能评分等方面进行评价,并结合实验研究结果,全面探讨分析创伤骨折术后中药熏洗应用的合适时机,以指导临床实践。方法：1.实验研究一成年健康SPF级SD大鼠60只,体重220±20g,雌雄各半,适应性喂养一周后,参照文献进行造模。造模后,按照NDST新药设计标准要求,将大鼠随机分为4组：正常大鼠组、模型组、生理盐水组、舒筋洗外用颗粒组(简称舒筋洗组),每组15只。大鼠造模后第2周(伤口己愈合)开始进行干预措施,舒筋洗组采用舒筋洗外用颗粒熏洗患肢,生理盐水组采用0.9%氯化钠注射液熏洗患肢,模型组造模后不采用任何干预措施,正常大鼠组不予任何处理。舒筋洗组、生理盐水组大鼠每天进行熏洗2次(水温控制在40-45℃C),每次30分钟。舒筋洗组、生理盐水组在采用干预措施后的第7天、14天、21天三个时相点取材,每组每次5只。模型组、正常组与前两组同期取材,每组每次5只。观察及检测指标有损伤症候指数、酶联免疫分析法检测(ELISA)血清中IL-1β与IL-6的含量、HE染色病理组织形态学观察、免疫组化、RT-PCR及Western-blot等方法相结合检测损伤软组织中PDGF与TGF-β的蛋白表达变化。统计方法采用SPSS16.0软件进行统计,各组均数比较采用单因素方差分析,组间比较若方差齐性采用最小显著差法(LSD),组间比较若方差不齐采用Dnnett法。2.实验研究二成年健康SPF级SD大鼠60只,体重220±20g,雌雄各半,造模同上。造模后,按照NDST新药设计标准要求,将动物随机分为A组、B组、C组和D组,每组15只。A组是在造模后第二周(伤口已愈合)开始采用舒筋洗外用颗粒熏洗干预,B组是在造模后第三周干预,C组是在造模后第四周干预,D组在造模后不采用任何干预措施。A、B、C组大鼠每天均进行熏洗2次(水温控制在40-45℃C),每次30分钟。每组观察周期为3周,每周每组处死5只大鼠取材。观察及检测指标有损伤症候指数,酶联免疫分析法检测(ELISA)血清中IL-1β、IL-6的含量,HE染色病理组织形态学观察,免疫组化、RT-PCR及Western-blot等方法相结合检测损伤软组织中PDGF与TGF-β的蛋白表达变化。统计方法同上。3.临床研究本研究以涉及肘关节的骨折为代表,病例全部来自佛山市中医院骨科住院患者,共120例,病例收集时间2012年6月至2013年12月。按照随机原则以入诊的先后顺序分为：A组30例,男17例,女13例,平均年龄(33.03±9.53)；B组30例,男18例,女12例,平均年龄(34.90±10.20)；C组30例,男15例,女15例,平均年龄(34.66±10.89)；D组30例,男16例,女14例,平均年龄(32.50±9.53)。以上病例均为新鲜骨折。四组一般资料进行比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。观察指标有疼痛、肿胀程度、肘关节ROM评测、皮肤反应情况、安全性及Mayo肘关节功能评分等方面。干预措施：A组于术后第3周(伤口已愈合)开始运用舒筋洗外用颗粒熏洗骨折处；B组于术后第4周开始；C组于术后第5周开始；D组术后不予任何干预措施(空白组)。统计方法采用SPSS16.0软件进行统计,各组均数比较采用单因素方差分析,组间比较若方差齐性采用最小显著差法(LSD),若方差不齐采用Dnnett法,不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。结果：1.实验研究一结果干预措施对损伤症候指数的影响：在干预后第7天,生理盐水组和舒筋洗组评分值基本一致,两组评分值均高于模型组；在干预后第14天、21天,模型组和生理盐水组评分值均有下降趋势,舒筋洗组评分值也有下降趋势,但在不同时期评分值均高于模型组和生理盐水组。干预措施对血清中IL-1β含量的影响：在干预后的不同时期,生理盐水组、舒筋洗组血清中IL-1β的含量均比正常大鼠组、模型组高,且舒筋洗组血清中IL-1β的含量比生理盐水组高。干预措施对血清中IL-6含量的影响：在干预后不同时期,生理盐水组、舒筋洗组血清中IL-6的含量均比正常大鼠组、模型组高,且舒筋洗组血清中IL-6的含量比生理盐水组高。HE染色病理形态学观察：正常大鼠组可见肌纤维基本一致,核分布比较均匀,位于胞浆周边部；模型组在干预不同时期,可见部分肌纤维排列疏松,散在少量炎性细胞；生理盐水组在干预后第7、14天,肌纤维间可见散在炎性细胞,在干预后第21天,可见结缔组织增生较明显,毛细血管增生,存在较多炎性细胞；舒筋洗组在干预后第7天,可见皮下组织炎症细胞浸润,散在出血,在干预后第14天,肌肉间散在炎性细胞较多,在干预后第21天,结缔组织增生明显,可见纤维母细胞,存在大量炎症细胞。干预措施对PDGF的影响：免疫组化检测结果显示,在干预后不同时期,舒筋洗组、生理盐水组软组织中PDGF蛋白表达分别高于模型组、正常大鼠组,且舒筋洗组比生理盐水组高。RT-PCR、Western-blot检测结果显示出与免疫组化一致的结果。干预措施对TGF-β的影响：免疫组化检测结果显示,在干预后第7、14天,舒筋洗组、生理盐水组损伤软组织中TGF-β蛋白表达明显高于模型组、正常大鼠组,且舒筋洗组比生理盐水组高。在干预后第21天,舒筋洗组损伤软组织中TGF-β蛋白表达分别高于生理盐水组、模型组、正常大鼠组。RT-PCR、Western-blot检测结果显示出与免疫组化一致的结果。2.实验研究二结果干预措施对损伤症候指数的影响：在干预后不同时期,A组评分值高于B组、C组、D组。干预措施对血清中IL-1β含量的影响：在干预后不同时期,A组血清中IL-1β含量明显高于B组、C组、D组,B组血清中IL-1β含量明显高于C组。干预措施对血清中IL-6含量的影响：在干预后不同时期,A组血清中IL-6含量高于B组、C组、D组,B组血清中IL-6含量高于C组。HE染色病理形态学观察：A组随着干预的不断进行,肌肉间隙炎性细胞逐渐增多,到后期即使结缔组织增生,也仍有大量炎性细胞浸润；B组随着干预的不断进行,肌纤维之间炎性细胞数量逐渐减少；C组随着干预的不断进行,肌纤维之间的炎性细胞数量也是逐渐减少的,但是较B组数量少；D组没有采用熏洗干预措施,在干预不同时期,可见部分肌纤维排列疏松,只有少量炎性细胞存在。干预措施对PDGF的影响：免疫组化检测结果显示,在干预后不同时期,A组损伤软组织中PDGF的灰度值分别高于B组、C组、D组,B组损伤软组织中PDGF的灰度值高于C组。RT-PCR、Western-blot检测结果显示出与免疫组化一致的结果。干预措施对TGF-β的影响：免疫组化检测结果显示,在干预后不同时期,A组软组织中TGF-β蛋白表达量分别高于B组、C组、D组,B组软组织中TGF-β蛋白表达量高于C组。RT-PCR、Western-blot检测结果显示出与免疫组化一致的结果。3.临床研究结果疼痛：在干预不同时期,A组疼痛分值最高,其次是B组,再次是C组。肿胀：在干预不同时期,A组肿胀程度最重,其次是B组,再次是C组。肘关节ROM评测(包括屈曲、背伸、旋前、旋后)：在干预后不同时期,A组肘关节活动范围最小,B组肘关节活动度较大,而C组肘关节活动范围最大。Mayo(?)寸关节功能评价：在干预后不同时期,A组肘关节功能恢复的最差,B组肘关节功能恢复优于A组,C组则优于A组、B组。特别要提出的是,在最后一次随访时,C组Mayo肘关节功能评分为优,B组为良,A组为可。皮肤反应：仅发现一例患者使用舒筋洗药外用颗粒熏洗后出现红斑,原因系熏洗温度过高引起的,与药物无关。安全性评价：在试验期间,各组患者均耐受性良好,无出现不良反应,评分为0级。结论：1.在创伤修复的细胞增殖分化阶段,运用生理盐水、舒筋洗外用颗粒熏洗等不同干预措施后,均不同程度地使血清中IL-1β和工L-6的含量升高,它们的过度表达或分泌均可造成局部过度炎症反应的发生,进而影响了创伤修复的进程。HE染色切片可从病理形态方面得到进一步印证,熏洗干预可引起局部过度炎症反应的发生,并造成增生性瘢痕的生成。由于舒筋洗组在炎性因子、症候指数、病理学等方面均比生理盐水组严重,所以认为应用舒筋洗药熏洗引起的局部过度炎症反应比生理盐水熏洗严重。2.运用熏洗干预措施后,造成了局部损伤软组织中PDGF和TGF-β的过度分泌或表达,可导致增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的出现,其中舒筋洗药熏洗最为严重,所以说不适当熏洗干预会对创伤修复造成不利的影响。3.不同时间点运用舒筋洗药熏洗干预后,均可造成炎性反应重新发生或加重,所以认为在创伤后前四周(即创伤修复的细胞增殖分化阶段)不适宜运用舒筋洗外用颗粒进行熏洗干预。4.创伤后前四周(即在创伤修复的细胞增殖分化阶段)不适宜运用舒筋洗外用颗粒进行熏洗干预,否则可能会导致局部增生性瘢痕或纤维化,影响创伤修复的进程。5.将实验研究结果与临床研究结果相结合后得出,患者创伤处疼痛、肿胀及肘关节功能恢复差等情况,可能与细胞因子IL-1β、PDGF、TGF-β过多分泌或异常表达有关,造成了局部炎症反应加重、过度纤维化及增生性瘢痕等情况,导致关节周围肌腱及肌肉之间纤维化粘连、肉芽组织增生明显,严重影响到关节的活动度及功能恢复,因此临床上在细胞增殖分化阶段(即骨折术后第5周之前)应用熏洗干预是不适宜的。
【作者】郭晓辉；
【导师】陈志维；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医骨伤科学（专业学位），2014，博士
【关键词】熏洗；白介素-1β；白介素-6；血小板衍化生长因子；转化生子因子；创伤修复；

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