特发性炎性肌病患者肌炎特异性抗体的临床表型研究以及自身免疫性肌炎小鼠模型的建立

【摘要】[目的]1.抗Mi-2抗体和抗信号识别颗粒(SRP)抗体是经典的肌炎特异性抗体,目前尚不十分清楚两者在我国肌炎患者群体中的阳性率及其相关临床表型(临床及血清学特征)。本研究通过大样本肌炎病例的血清学检测与临床资料分析,并与国内外研究结果进行比较,从而归纳总结本研究中心肌炎患者中抗Mi-2抗体和抗SRP抗体的阳性率及其相关肌炎亚型的临床表型特征,为临床医师诊治抗Mi-2/SRP抗体相关肌炎提供有价值的参考依据。2.采用自身免疫性肌炎动物模型研究人类特发性炎性肌病的发病机制是一种常用且重要的实验方法,目前美国和日本等国学者构建新型自身免疫性肌炎动物模型技术先进成熟,国内尚缺乏新型肌炎模型构建的研究。本研究采用原核表达和亲和层析法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C(MYBPC2),通过免疫小鼠获得自身免疫性肌炎模型,为研究肌炎的发病机制提供一种新型有效的实验工具。[方法]1.采用免疫印迹法检测多发性肌炎(PM)/皮肌炎(DM)患者血清中抗Mi-2抗体和抗SRP抗体的阳性率,回顾性分析各抗体阳性患者的临床特征和肌肉病理特征,并随访其病情,通过文献检索和分析完成抗Mi-2抗体和抗SRP抗体相关肌炎的系统综述。2.根据MYBPC2的序列设计引物,将其第284至579位氨基酸残基对应的碱基序列亚克隆至pMALc-5e载体中,并转化至大肠杆菌表达MYBPC2重组蛋白,亲和层析法纯化。以抗MYBPC2抗体证实所表达蛋白的正确性,以纯化蛋白免疫动物获得免疫血清,免疫印迹法鉴定蛋白的免疫原性。再以纯化的MYBPC2与完全弗氏佐剂乳化后,以皮下多点注射免疫C57BL/6小鼠(0天、7天),同时腹腔注射百日咳毒素2ug。(1)探索不同剂量的MYBPC2免疫小鼠,在不同时点肌肉病理变化情况。(2)以600ug/次免疫小鼠,在第21天检测小鼠肌肉耐力,观察肌肉组织MHC-I类分子以及炎症细胞浸润等病理变化。[结果]1.125例PM/DM患者中抗Mi-2抗体阳性5例,均为DM患者,总体阳性率4%,在DM患者中阳性率为5.6%。该抗体阳性患者与阴性患者相比,Gottron皮疹、Heliotrope疹、面部红斑、四肢肌肉受累的发生率较高,但无统计学差异。结合文献分析,该抗体阳性者合并肺间质病变及心脏受累较少见,与伴发肿瘤无明显关联,免疫治疗应答率在70%以上。肌组织病理主要表现为血管周围炎症细胞浸润,肌纤维MHC-I类分子表达上调,T淋巴细胞浸润为主。2.148例肌炎患者中抗SRP抗体阳性9例,均为PM患者,总体阳性率6.08%,在PM中阳性率为21.43%。该抗体阳性患者与抗体阴性的PM患者临床特征相比,吞咽困难发生率高(P=0.005),C反应蛋白升高率低(P=0.04)。与抗Jo-1抗体阳性患者相比,在发热、吞咽困难、合并间质性肺病、血沉和C反应蛋白水平方面具有显著差异(P<0.05)。结合文献分析,心脏严重合并症发生率低,与肺间质病变发生无显著关联。肌肉病理特点为肌纤维散在变性、萎缩和坏死,肌纤维MHC-I类分子阳性表达,T淋巴细胞呈散在或灶性浸润肌内膜,血管周围炎细胞浸润少见,未见明显肌纤维肥大、束周萎缩和B细胞浸润。8例患者接受免疫抑制治疗,平均随访20.6月,完全缓解率为37.5%,部分缓解率50%。3.MYBPC2蛋白表达载体构建成功,每升大肠杆菌菌液可生产纯化后的重组MYBPC2蛋白约30mg,WesternBlot显示重组蛋白与其抗体及抗血清特异结合。4.(1)随免疫剂量增加,肌肉损伤和炎症趋于严重,在21、28天肌组织损伤最显著,模型组小鼠肌组织可见肌纤维变性、坏死和炎细胞浸润。(2)小鼠模型组肌肉耐力与对照组相比明显下降(P=0.017)。模型组小鼠肌纤维表面MHC-I类分子阳性,肌纤维之间及血管周围区域可见散在CD4+以及CD8+T淋巴细胞、CD68+巨噬细胞浸润,CD20+B淋巴细胞主要分布于血管周围区域,肌纤维间少见。[结论]1.本研究中心PM/DM患者中抗Mi-2抗体的阳性率是4%,在DM中的阳性率是5.6%；抗Mi-2抗体是皮肌炎相对特异性抗体；抗Mi-2抗体相关皮肌炎的临床表型为皮疹和肌肉受累较为突出,肌肉病理无明显特异性,与伴发肿瘤无明显关联,治疗反应良好,预后个体差异较大。2.本研究中心PM/DM患者中抗SRP抗体的阳性率是6.08%,在PM中阳性率为21.43%;抗SRP抗体是PM相对特异性抗体；抗SRP抗体相关多发性肌炎的临床表型特征为与吞咽困难发生显著相关,心脏严重合并症发生率低。肌肉组织存在T淋巴细胞浸润,免疫抑制剂的应答率及短期预后较好。3.MYBPC2重组蛋白具备良好的抗原特异性和免疫原性,制备方法稳定高效。4.在国内首次采用MYBPC2成功诱导出小鼠自身免疫性肌炎。MYBPC2诱导的新型自身免疫性肌炎模型具备人类多发性肌炎相似的临床和肌肉病理特征,能够做为研究特发性炎性肌病发病机制的新型工具。
【作者】张寅丽；
【导师】王国春；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】特发性炎性肌病；抗Mi-2抗体；抗SRP抗体；动物模型；快型肌球蛋白结合蛋白C；

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