ER-AR+乳腺癌细胞中AR活化信号相关miRNA及其靶蛋白的研究
【摘要】研究背景：作为性激素依赖性的肿瘤,乳腺癌的发病率和死亡率均居女性恶性肿瘤的首位,一直以来都是肿瘤研究者关注的重点。相对于雌激素受体(estrogenreceptor,ER)和孕激素受体(progesteronereceptor,PR),雄激素受体(androgenreceptor,AR)在乳腺癌生物学中的作用是临床和基础研究中被忽略的领域。近年来国外越来越多的实验研究表明AR与乳腺癌的发生、发展和预后密切相关。国内外的许多文献报告结果显示,AR高表达于乳腺癌,在ER阴性的病例有大约1/2的病例AR是阳性的,而且AR阳性乳腺癌患者的临床过程和预后较好。因此搞清AR在乳腺癌中的作用机制,对进一步认识乳腺癌的生物学行为及发展新的治疗方法有着重要意义。已有的研究表明AR通过与雄激素反应元件结合而活化,从而调节靶基因的转录,影响细胞内的基因表达程序,包括微小RNA(micro-ribonucleicacid,microRNA,miRNA)的改变,而近年来非编码的具有重要调控作用的miRNA正是肿瘤研究领域的热点,由于miRNA的改变可以负调控其靶蛋白的表达,因此其既可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性；也可作为癌基因,下调抑癌基因的活性。我们的前期研究结果显示,雄激素二氢睾酮(dihydrotestosterone,DHT)可以抑制ER-AR+MDA-MB-453乳腺癌细胞增殖,使细胞周期阻滞在G1-S期,提高AR蛋白的表达,miRNA芯片杂交结果筛选出明显上调和下调的miRNA。本研究在前期研究的基础上,从筛选出的miRNA中找到有意义的2个miRNA进行了深入研究并取得了一些重要发现。研究目的：1.明确let-7a与AR活化之间的相关性,并对let-7a进行细胞功能学研究,阐明AR活化、let-7a及其靶蛋白在DHT抑制ER-AR+乳腺癌细胞增殖中的重要作用。2.明确miR-30a与AR活化之间的相关性,对miR-30a进行细胞功能学研究,证实其靶蛋白是否为通过生物信息学方法发现的AR,阐明AR和miR-30a之间的关系及其在DHT抑制ER-AR+乳腺癌细胞增殖中的重要作用。研究方法：1.分析miRNA芯片杂交结果,生物信息学技术预测靶基因为AR的可能miRNA。2.采用实时定量RT-PCR方法,验证miRNA芯片杂交筛选出的明显上调的miRNAlet-7a和明显下调的miR-30a,b,c。3.染色质免疫沉淀技术证实AR活化与let-7a和miR-30a启动子的相互作用。4.通过Westernblot技术检测乳腺癌细胞中AR、c-Myc和k-Ras蛋白的表达。5.通过构建质粒和细胞转染实验使细胞中的miRNA上调。6.通过转染miRNA特异性反义寡核苷酸(specificantisenseoligonucleotide,ASO)使细胞中的miRNA下调。7.MTT和流式细胞术方法检测细胞增殖和细胞周期的变化。8.应用双荧光蛋白报告基因分析系统证实AR为niR-30a的靶基因。研究结果：1.对miRNA芯片杂交筛选出的miRNA结果进行分析发现上调大于1.5倍,的miRNA有43个,其中包括let-7a,b,c,d,e,g六个,进一步分析发现只有其中的let-7a,b,c,d为上调大于2倍,且信号值大于1000的miRNA;下调大于1.5倍的miRNA有51个,其中包括miR-30a,b,C。2.生物信息学预测软件预测靶基因为AR的可能的且在miRNA芯片杂交筛选出的有意义的miRNA为niR-30a,b,c。3.对let-7a及miR-30a,b,c进行实时定量RT-PCR,结果显示let-7a的上调倍数近13倍,miR-30a下调5倍,miR-30b下调大于2倍,miR-30c下调接近2倍,选择上调的let-7a及下调的miR-30a进一步研究。4.染色质免疫沉淀证实了AR活化后可以直接上调let-7a,但不直接调节miR-30a。5.DHT刺激MDA-MB-453细胞后,c-Myc和k-Ras表达下调,AR表达上调。6.实时定量RT-PCR证实细胞转染成功,与对照组相比,在转染过表达质粒组let-7a和miR-30表达上调,转染ASO组let-7a和miR-30表达下调7.MDA-MB-453细胞转染后,在let-7a低表达组,细胞增殖活性增高；细胞周期中S期细胞比例增加,G1期细胞比例减少;let-7a的已知靶蛋白c-Myc和k-Ras表达上调。在let-7a高表达组,则出现相反的结果。8.MDA-MB-453细胞转染后,在miR-30a低表达组,细胞增殖活性增高；细胞周期中S期细胞比例增加,G1期细胞比例减少,预测的靶蛋白AR表达上调。在miR-30a高表达组,则出现相反的结果。9.双荧光蛋白报告基因分析系统证实了AR为：miR-30a的靶基因。结论：1.作为转录因子AR活化可以作用于let-7a的启动子直接上调let-7a。2.AR是miR-30a的靶蛋白,受miR-30a的直接调控。3.let-7a和：miR-30a均为抑癌miRNA。4.雄激素诱导的AR活化直接上调let-7a,let-7a又下调其靶蛋白c-Myc和k-Ras,这一信号通路雄激素抑制ER-AR+乳腺癌细胞生长过程中发挥重要作用。5.miR-30a为抑癌miRNA,而雄激素诱导的AR活化可以下调miR-30a,但对miR-30a没有直接调控作用,miR-30a在雄激素抑制ER-AR+乳腺癌细胞生长过程中的作用可能主要是通过上调其靶蛋白AR实现的。
【作者】吕淑华；
【导师】牛昀；
【作者基本信息】天津医科大学，肿瘤学，2013，博士
【关键词】乳腺癌；雄激素受体；let-7a；miR-30a；靶蛋白；
【参考文献】
[1]倪瑾.共青团的功能定位：组织动员和资源整合[D].华东师范大学,政治学理论,2014,博士.
[2]孙思旺.刘禹锡方药研究的思想背景论略[D].湖南大学,专门史,2003,硕士.
[3]朱可可.不同耕作措施对夏大豆田土壤肥力和水氮利用的影响[D].河南科技大学,作物（专业学位）,2014,硕士.
[4]路正刚,刘洪臣,史真,王所亭,吴殿久,原新成,龚小燕.放疗后狗下颌种植体周围骨密度变化初探[J].口腔颌面修复学杂志.2001(01)
[5]康重庆,牟涛,夏清.电力系统多级负荷预测及其协调问题(一)研究框架[J].电力系统自动化,2008,07:34-38.
[6]张晓天.山西省城镇化与生态环境协调发展度分析[D].山西师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[7]欧剑波,罗安,唐杰,涂春鸣,姚舜.基于神经元自适应PID的STATCOM直接电压控制方法[J].电力系统自动化,2007,12:77-80.
[8]王若馨.玄贝消痤汤治疗痰湿瘀滞型痤疮的临床观察[D].黑龙江中医药大学,中医外科学（专业学位）,2014,硕士.
[9]修春波,刘向东,张宇河.双混沌机制优化方法及其应用[J].控制与决策,2003,06:724-726.
[10]王成双,金其诚,谢鸿峰,程镕时.氧化石墨辐照接枝聚丙烯酸和聚丙烯酰胺的研究[A].中国化学会高分子学科委员会.2011年全国高分子学术论文报告会论文摘要集[C].中国化学会高分子学科委员会:,2011:1.
[11]赵衡.新型电能质量监测装置的研究[D].华北电力大学（河北）,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[12]王健.我国商业银行同业拆借利率风险的VaR度量研究[D].贵州财经大学,应用统计,2013,硕士.
[13]田园,马孜,胡英,汪洋.一种自适应振动主动控制策略及其在C型三维表面检测系统中的应用[J].控制与决策,2009,04:557-559+564.
[14]杨洪杰.胸腰椎压缩骨折过伸复位枕弧面放射学参数的测定[D].广州中医药大学,中医骨伤科学,2013,硕士.
[15]唐鑫萍.利津洼陷古近系沙四上亚段薄互层砂岩的成岩作用[D].中国地质大学（北京）,矿产普查与勘探,2013,硕士.
[16]陈嵩,沙长涛,谭剑勇.射频开路阻抗标准器定标方法研究[J].北京交通大学学报,2014,02:8-12.
[17]刘润芝.湘西地区传统商业街空间环境营造研究[D].湖南大学,建筑学,2011,硕士.
[18]倪美萍.顶空富集方法在检测药物挥发性组分中的理论研究及应用[D].河北医科大学,药物分析学,2013,硕士.
[19]张玲玲.中药育发液治疗脂溢性脱发药效评价及其作用机理研究[D].广州中医药大学,中药学,2013,硕士.
[20]本报记者刘增兵.贵州新碳高科推出我国首个纯石墨烯粉末产品[N].贵州日报,2013-04-07008.
[21]袁德鑫,赖盛刚.总结经验不断开拓——对搞好石化重大装备国产化的几点意见[J].石油化工设备.1993(01)
[22]徐常练.三参量速度分析中的构造形态约束[J].石油地球物理勘探,1995,05:615-622+658-718.
[23]宋艳霞.阿诺德·伯林特审美理论研究[D].山东大学,文艺学,2014,博士.
[24]刘芳芳.先秦简帛科技文献研究[D].辽宁大学,历史文献学,2012,硕士.
[25]张庆明.阻断水貂肠炎细小病毒感染F81细胞的多肽筛选与验证[D].吉林大学,动物营养与饲料科学,2013,硕士.
[26]张大印.基于协同过滤的可信服务选择研究[D].南京邮电大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[27]李正兵.FMS运控软件快速开发技术研究[D].南京航空航天大学,机械电子工程,2004,硕士.
[28]陈振.层板结构微小通道内流动与传热特性研究[D].国防科学技术大学,工程热物理,2012,硕士.
[29]袁丹.基于实验分析的吴语语音变异研究[D].复旦大学,语言学及应用语言学,2013,博士.
[30]卫柏岩.k极大子群较少的有限P群[D].山西师范大学,基础数学,2014,硕士.
[31]周福娜.多传感器数据融合与线性逆问题的多尺度求解方法[D].河南大学,基础数学,2004,硕士.
[32]张淑英.中国煤炭工业低碳发展研究[D].中国矿业大学（北京）,管理科学与工程,2012,博士.
[33]吴艳娟.移动交换无线网络联合优化技术与应用[D].湖南大学,软件工程,2013,硕士.
[34]黄康.中国企业跨国并购人力资源整合风险及对策研究[D].西南大学,企业管理,2014,硕士.
[35]高远.压电晶体器件衬底超精密清洗的研究[D].大连理工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]马本江,谭春桥,陈晓红,毕文杰,陈可.大型群体多属性决策的目标函数线性回归法[J].控制与决策,2010,04:546-550.
[37]彭巾又.名词化在大学生英语写作中的应用：从功能语法角度分析[D].西南交通大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[38]寿娜.基于图像的行人检测系统研究[D].浙江工业大学,2013.
[39]杨永春.村级债务化解实例及其策略[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[40]冯转.文化的冲突与融合：陌生化视域下《喜福会》解读[D].兰州大学,英语语言文学,2014,硕士.
[41]刘清洋.话语、身体、权力—对品特三部剧作的话语分析[D].湖南师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[42]周君.小学语文教科书性别角色分析[D].华中师范大学,小学教育（专业学位）,2014,硕士.
[43]石怀瑞.缺氧心肌细胞代谢产物对成纤维细胞迁徙的诱导作用[D].华中科技大学,内科学,2013,硕士.
[44]高峰.小型支线集装箱船结构设计研究[D].上海交通大学,船舶与海洋工程,2013,硕士.
[45]闫飞,庄严,白明,王伟.基于拓扑高程模型的室外三维环境建模与路径规划[J].自动化学报,2010,11:1493-1501.
[46]张元灏.大学生网络学习自我效能感与网络社会支持的关系研究[D].华中师范大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[47]赵锦鹏.汽车二级维护技术管理研究[D].大连海事大学,项目管理,2012,硕士.
[48]王沛霖.一种称重传感器的研制[D].吉林大学,无线电物理,2014,硕士.
[49]叶镕.分离交易可转债的风险与对策研究[D].东北大学,会计学,2009,硕士.
[50]徐胜.半潜式平台运动耦合分析方法及水动力模型试验研究[D].江苏科技大学,船舶与海洋结构物设计制造,2012,硕士.
