甲状腺激素通过整合素α_vβ_3/PKD/HDAC5信号转导通路促血管新生作用研究

【摘要】目的：近期研究显示,甲状腺激素具有促血管新生作用,膜受体整合素Ωvβ3在其中发挥了重要作用,但其具体的信号转导通路尚未完全明了,本研究利用人脐静脉内皮细胞(HUVEC),研究甲状腺激素(T4)与膜受体整合素αvβ3结合,通过蛋白激酶D(PKD)-组蛋白去乙酰化(HDAC)5信号转导通路,在表观遗传方面引起某些促血管新生因子的表达发挥促血管新生作用。同时利用人胶质母细胞瘤(SNB19)细胞,探讨甲状腺激素及其类似物(Tetrac)对肿瘤细胞增殖与凋亡的影响。方法：第1部分：甲状腺激素促血管新生作用研究。培养HUVEC细胞分为对照组、T4干预组(100nmol/L)、Tetrac干预组(100nmol/L)、Tetrac+T4干预组(100nmol/LTetrac+100nmol/LT4)、蛋白激酶C(PKC)抑制剂(2.5μmol/L)干预组,PKC抑制剂(2.5μmol/L)+T4(100nmol/L)干预组。提取细胞总蛋白,应用Western印迹法检测培养细胞PKD及HDAC5的磷酸化。应用RNA干扰技术,向HUVEC细胞内转染PKDsiRNA,再给予生理浓度的T4(100nmol/L)处理15min,30min,提取细胞总蛋白,Western印迹法检测PKD及HDAC5的磷酸化。应用核浆蛋白分离提取试剂盒分离核浆蛋白,利用Western印迹法检测细胞浆内磷酸化HDAC5的蛋白水平。HUVEC细胞分为对照组、T4干预组(100nmol/L)、Tetrac干预组(100nmol/L)Tetrac+T4干预组(100nmol/LTetrac+100nmol/LT4),分别干预2h,4h,6h并提取细胞总RNA,应用RT-PCR法检钡bFGFmRNA的表达。另外,HUVEC细胞分为对照组、T4干预组(100mol/L)、Tetrac干预组(100nmol/L)Tetrac+T4干预组(100nmol/LTetrac+100nmol/LT4)。通过划痕修复实验分别记录HUVEC在干预条件下0h,8h,12h,24h的迁移距离。Matrigel体外成管试验：HUVEC细胞分为对照组及T4干预组,(1)将Matrigel胶与细胞悬液混合后,接种于96孔板,每孔50μl,5%C02,37℃孵育30min,待Matrigel胶凝固后,每孔加入250μ1完全培养液,48h后撤去血清,加入不同处理条件,培养72h,观察记录检测HUVEC在干预条件下成管的数量。(2)将Matrigel胶铺于96孔,5%CO2,37℃30min,待Matrigel胶凝固后,每孔加入200μl细胞悬液,培养4h,观察形成管状结构的数量。第2部分：培养SNB19细胞,分为对照组、T4干预组(100nmol/L)、Tetrac干预组(100nmol/L)、Tetrac+T4干预组(不同浓度Tetrac+100nmol/LT4)。MTT法检测SNB19在干预条件下24h,48h,72h的细胞存活率。流式细胞术检测SNB19细胞在上述干预条件下48h时的细胞凋亡率。结果：(1)与对照组相比,T4干预组PKD的磷酸化增加(P<0.05)；与T4干预组相比,Tetrac干预组及Tetrac+T4干预组PKD的磷酸化降低,且Tetrac的抑制作用具有浓度依赖性(P均<0.05)；与T4干预组相比,PKC抑制剂干预组、PKC抑制剂+T4干预组PKD的磷酸化也降低(P均<0.05)。与对照组相比,T4干预组HDAC5的磷酸化增加(P<0.05)；Tetrac干预组及Tetrac+T4干预组HDAC5的磷酸化降低,但Tetrac的抑制作用没有浓度依赖性(P>0.05)。PKDsiRNA在mRNA及蛋白水平均可明显降低PKD的表达,同时,转染了PKDsiRNA的HUVEC细胞HDAC5的磷酸化受抑制(P<0.05)。与对照组相比,T4干预组细胞浆内磷酸化HDAC5增加,而PKC抑制剂、PKC抑制剂+T4干预组、Tetrac干预组及Tetrac+T4干预组磷酸化HDAC5表达降低(P<0.05)。与对照组相比,T4干预组HUVEC中bFGFmRNA表达增加(P<0.05),而Tetrac干预组及Tetrac+T4干预组与T4干预组相比,bFGFmRNA表达降低(P<0.05)。与对照组相比,T4干预组HUVEC迁移距离较长(P<0.05),与T4干预组相比,Tetrac干预组及Tetrac+T4干预组迁移距离较短(P<0.05)。与对照组相比,T4干预组成管数量较多(P<0.05)。(2)与对照组相比,T4干预组SNB19细胞存活率没有明显差异,但Tetrac干预组SNB19细胞存活率降低(P<0.05),且具有浓度依赖性(P<0.05)。与对照组相比,T4干预组SNB19细胞凋亡率没有明显差异,而Tetrac干预组SNB19细胞凋亡率增加(P<0.05),且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论(1)甲状腺激素通过整合素αvβ3/PKC/PKD/HDAC5信号转导通路促进bFGFmRNA的表达,从而在表观遗传学层面发挥促血管新生作用。对于体外培养HUVEC,甲状腺激素可促进其迁移及形成管腔样结构。(2)甲状腺激素在一定程度上可促进肿瘤细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的凋亡。Tetrac作为甲状腺激素类似物,在阻断甲状腺激素作用于整合素αvβ3的同时,可抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。
【作者】刘欣；
【导师】李兰英；
【作者基本信息】天津医科大学，病理学与病理生理学，2013，博士
【关键词】甲状腺激素；血管新生；整合素αvβ3；蛋白激酶D；组蛋白去乙酰化酶5；碱性成纤维细胞因子；人脐静脉内皮细胞；人胶质母细胞瘤细胞；

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