基于大肠腑实证肠粘膜屏障损伤与肺ALI/ARDS发生相关性研究

基于大肠腑实证肠粘膜屏障损伤与肺ALI/ARDS发生相关性研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-28 分类:开题报告 喜欢:2624
师大云端图书馆

【摘要】目的建立“大肠腑实证”由肠及肺动物模型并探索大鼠肠淋巴液引流的操作技术;分别观察模型组大鼠与假手术组大鼠肠淋巴液成分的差别;探讨肠-淋巴途径在大肠腑实证大鼠急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)中的作用及其可能的分子机制Toll样受体4(tolllikereceptor-4,TLR-4)信号通路。方法建立并熟练掌握大鼠肠淋巴液引流的方法。选用Wistar大鼠20只,随机分为模型组和假手术组;取大鼠肺组织与末端回肠组织,行病理学观察,并于电镜下观察肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞及肠组织上皮细胞紧密连接结构。采用原位末端转移酶标记技术(TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling,TUNEL)检测肺组织与末端回肠组织细胞凋亡程度。同时分别引流各组大鼠的肠系膜淋巴液,进行白细胞计数及分类;检测淋巴液中内毒素水平,碱性磷酸酶(alklinephosphatase,AKP)、乳酸脱氢酶(1actatedehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatinekinase,CK)、谷氨酰胺转移酶(GlutathioneSTransferase,GST)活性以及各细胞因子的浓度。将收集的模型组及假手术组大鼠的肠淋巴液,经右侧颈内静脉以1mL/h的速度分别回输给健康大鼠,回输肠淋巴液的剂量为0.35mL/100g。回输4h后,迅速留取全肺组织,应用光学显微镜观察两组大鼠肺组织病理学变化,测定肺湿/干质量比值(wet/dryweightratio,W/D)及髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性,并检测肺组织匀浆中肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactoralpha,TNF-a)及白介素6(interleukin-6,IL-6)的水平。此外,在大肠腑实证模型的基础上,结扎肠系膜淋巴管并引流肠系膜淋巴液,建立肠系膜淋巴液引流组,应用酶化学法分别检测模型组、引流组及假手术组末端回肠组织二胺氧化酶(diamineoxidase,DAO)活性、肠组织与肺组织MPO水平;鲎试剂检测血浆及肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中内毒素水平;观察肺血管通透性的改变;观察BALF中白细胞比例的变化;Elisa法分别测定血浆及BALF中细胞因子、粘附因子、趋化因子水平以及组织中炎症因子水平。Westernblotting法分别检测各组大鼠肺组织与回肠组织中TLR-4、核因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)、白细胞介素-1受体相关激酶-4(Interleukin-1receptor-associatedkinase4,IRAK-4)的蛋白表达水平,并进行NF-κB蛋白表达水平与淋巴液中TNF-α水平变化及TLR-4蛋白表达水平与淋巴液中内毒素水平变化的相关性分析。结果大鼠肠系膜淋巴液引流的成功率较高(95%)。大肠腑实证模型组肺、肠组织病理改变明显,电镜下可观察到模型组肺组织Ⅱ型肺泡上皮细胞,肠组织上皮细胞紧密连接结构破坏;并可观察到模型组肺组织与末端回肠组织细胞凋亡严重。大肠腑实证大鼠肠淋巴液中中性粒细胞比例较假手术组明显升高,而巨噬细胞及淋巴细胞比例较假手术组明显降低(P<0.01);大肠腑实证大鼠肠系膜淋巴液中内毒素水平,AKP、LDH、CK、GST活性及各细胞因子浓度均有所升高(P<0.01或P<0.05)。分别将两组淋巴液回输给正常大鼠后,观察到与假手术组肠淋巴液回输相比,“大肠腑实证”肠淋巴液回输组大鼠肺组织病理学改变明显加重,肺W/D及MPO活性显著升高(P<0.01),肺组织匀浆中TNF-a及IL-6水平显著升高(P<0.01)。此外,与假手术组比较,模型组肠组织DAO活性明显降低,MPO活性则明显升高,引流肠系膜淋巴液后可以升高肠组织DAO活性,降低MPO的活性。肺组织MPO活性及肺血管通透性模型组较假手术组明显升高,引流肠系膜淋巴液后可降低MPO水平并改善肺血管通透性。肺泡灌洗液中内毒素水平模型组明显升高,引流组较模型组降低有统计学差异,而血浆中内毒素水平各组间无统计学差异。模型组BALF白细胞中中性粒细胞比例明显升高,引流肠淋巴液后,引流组BALF中中性粒细胞比例可显著降低。此外,引流肠淋巴液后,可明显减轻血浆、BALF及组织的炎症反应,降低炎症因子、粘附因子及趋化因子的水平;降低肺与回肠组织中TLR-4、NF-κB、IRAK-4的蛋白表达水平;与肺及回肠组织病理切片变化相一致;并且经Pearson目关分析显示模型组NF-κB蛋白表达水平与淋巴液中TNF-α浓度变化、TLR-4蛋白表达水平与淋巴液中内毒素水平变化均呈正相关。结论大肠腑实证导致肺损伤模型复制成功,可为下一步肠淋巴途径的实验研究提供条件。建立起一套比较简便、易行的肠淋巴液引流方法。肠-淋巴途径可能是大肠腑实证导致远隔器官损伤早期的主要途径,大肠腑实证大鼠肠淋巴液自身即可引起健康大鼠急性肺损伤。TLR-4信号通路是大鼠肠系膜淋巴途径在大肠腑实证所致肺损伤的分子机制之一
【作者】张艳敏;
【导师】崔乃强;
【作者基本信息】天津医科大学,中西医结合临床,2014,博士
【关键词】大肠腑实证;肺损伤;肠淋巴液;肠淋巴途径;TLR-4信号通路;

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