基于Luminex平台的病毒性出血热多重血清学检测方法的建立及其评价

【摘要】病毒性出血热(ViralHemorrhagicFever,VHF)是由不同科多达几十种病毒引起的一组病毒性疾病,顾名思义,其典型的临床表现为发热和出血,严重的会引起休克、弥散性血管内凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)和中枢神经系统损伤甚至导致死亡。出血热病毒主要在布尼亚病毒科、沙粒病毒科、丝状病毒科和黄病毒科四个科,部分病毒感染所引起疾病的病死率高达90%以上,病毒性出血热威胁着全球大部分人口。截止到目前,在国内发现并明确的病毒性出血热主要包括以下四种：流行性出血热、新疆出血热、登革出血热和严重发热伴血小板减少综合征。此外,随着全球自然环境的改变和现代交通的迅速发展,出现了一些新发现的出血热病毒并迅速传播,老出血热病毒的流行范围也呈不断扩散的趋势,如不加以有效控制将有可能带来严重的后果。快速、简便而又准确的病毒病诊断方法为病毒病治疗提供了必要的依据。不同病毒性出血热的临床表现接近,需要通过实验室特异性检测才能确定诊断。目前,病毒性出血热的实验室诊断方法主要包括病毒分离培养、ELISA法、RT-PCR法、免疫荧光法、免疫组化以及电镜等。上述方法各有优劣,但均不易实现多重血清学检测是它们的共同缺点。血清学检测是病毒病诊断不可或缺的重要手段,同时又需要在短时间内对可引起出血热的众多病毒进行筛查并最终确诊,就需要一项专门的技术来实现这一目标。Luminex技术是基于流式细胞技术、ELISA技术、化学发光技术、快速信号处理技术等多项技术为基础所研发的一种新型的高通量大分子检测平台,主要开发于上世纪90年代,又名悬浮芯片(suspensionarray)技术。本研究选取这一技术作为平台,建立起快速、敏感、高通量的病毒性出血热实验室血清学检测方法,以期达到对新发突发病毒性出血热临床样本快速筛查及诊断的目的,主要从以下几个方面开展工作：1.出血热病毒重组蛋白抗原的表达、纯化及鉴定本部分研究的主要目的是为建立病毒性出血热多重血清学检测方法提供足够量的优质检测抗原。首先完成了二十九种出血热病毒重组蛋白抗原的表达和纯化,在纯化方面每种抗原都采用了两种纯化方式,一种为金属离子亲和层析,另一种为切胶回收,前者作为检测抗原,后者作为免疫抗原免疫兔子获得多克隆兔血清作为质控标准品。在抗原表达方面,SFTSV-NP和HLV-NP分别采用了原核表达和真核表达,前者用于免疫动物,后者作为检测抗原。经鉴定,所有抗原的纯度都能达到90%以上,符合检测和免疫需求。另外,我们还完成了各抗原ELISA检测最佳包被量的优化,并评价了相应多克隆兔血清的IgG抗体滴度。2.Luminex多重血清学检测方法的建立和质控本部分研究的目的在于建立病毒性出血热多重血清学检测及其质控方法。首先利用ELISA和western-blot法评价了白蛉病毒属属内血清学交叉反应,为悬浮芯片多重检测方法的建立、评价及应用过程中可能存在的白蛉病毒属属内血清学交叉反应提供了依据。而后我们利用29种偶联了不同病毒重组蛋白抗原的荧光微球对相应兔血清进行了单重检测,评价了偶联效果以及每种兔血清中特异性IgG抗体的滴度,一般都能达到1：4096000。证明了偶联抗原后荧光微球在4℃避光保存的期限至少为一年。验证了同一批次纯化的抗原经不同批次偶联荧光微球后在检测IgG和IgM抗体过程中的批间差在统计学上无明显差异。为下一步将这一新建立的方法应用于临床血清样本奠定了基础。3.Luminex多重血清学检测方法对临床样本的筛查和诊断本部分研究的目的在于评价所建方法的临床检验效果。首先确定了10重荧光微球检测IgG抗体的cutoff值,并检测了一批HFRS病人和SFTS病人恢复期血清的IgG抗体,得到了每种抗原在检测特异性IgG抗体时的敏感度和特异度。在此前提下检测了一批未知病原感染的临床样本,确诊了部分HFRS病例和一例DHF病例。在10重荧光微球检测的基础之上,我们又进一步确定了29重荧光微球检测IgG抗体和IgM抗体的cutoff值,建立了去除血清中类风湿因子的方法。根据cutoff值检测了一批HFRS病人和SFTS病人恢复期血清的IgG抗体及急性期血清的IgM抗体,得到了每种抗原在检测特异性IgG和IgM抗体时的敏感度和特异度。在此前提下我们检测了一批未知病原感染的临床样本,检出了部分针对汉坦病毒NP抗原、SFTSV-NP抗原、HLV-NP抗原、CCHFV-NP抗原以及黄病毒-rEⅢ抗原的阳性血清,使用胶体金和RT-PCR法证实了部分SFTS感染病例。总之,我们建立起了一套基于Luminex技术的病毒性出血热多重血清学检测方法,并对之进行了质控和评价,证明了其在临床血清样本筛查及诊断中起到了十分重要的作用。
【作者】芜为；
【导师】李德新；
【作者基本信息】中国疾病预防控制中心，免疫学，2014，博士
【关键词】病毒性出血热；Luminex；多重血清学检测；诊断方法；

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