中国西北两省区结核分枝杆菌临床分离株基因多态性研究

【摘要】结核分枝杆菌的基因分型技术可以用于研究结核病的遗传多态性、暴发流行、感染传播模式、等等,对结核病的预防控制具有重要意义。目前研究结核分枝杆菌基因分型常用的方法有间隔区寡核苷酸分型(spaceroligonucleotidetyping,Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MultipleLociVNTRAnalysis,MLVA),这两种方法以PCR为基础,是多个国家和地区的结核病实验室进行结核分子流行病学研究的常用方法。结核分枝杆菌的基因分型研究显示,全球的结核分枝杆菌可以分为六大基因“家系”,每一基因“家系”的分子特征,地区性分布和致病性均具有独特性。为了解中国西北部新疆和甘肃两个地区结核病患者中结核分枝杆菌的基因多态性、主要的流行菌株,研究两地区间结核分枝杆菌基因多态性的差异,发现不同民族和不同地域间人口流动状况对菌株多态性的影响,并且探讨本实验室确定的MLVA基因分型方法中所使用的15个VNTR位点组合是否适合这两个地区结核病患者的分子流行病学研究,本研究用Spoligotyping和MLVA两种基因分型方法对新疆和甘肃两个地区的778株结核分枝杆菌进行了分子流行病学研究,并计算各VNTR位点的Hunter-Gaston旨数,分析各位点的分辨力。Spoligotyping分型结果显示778个菌株呈103种基因型,与SpolDB4.0数据库比对后发现,其中723株属于的7种已知基因家族,分别为北京家族、Haarlem家族、CAS家族、MANU家族、T家族、LAM家族和U家族,而其它55株呈49种基因型,在SpolDB4.0数据库中无匹配数据,为新基因型。对所有菌株进行聚类分析,其中705株结核分枝杆菌聚成30个基因簇(2～590株菌),成簇率为86.76%,其中590株菌具有相同的基因图谱,聚为最大一簇,而73株结核分枝杆菌独立成簇,表现为独特的基因型。在所分析的778个菌株中,主要流行株为北京家族菌株,共有634株,占全部菌株的81.49%。其次是T家族菌株,有45株,占全部菌株的5.78%。新疆地区311株临床分离株表现为68种基因型,其中277株属于7个已知家族,34株为新基因型,其中,主要流行株为北京家族菌株,共有224株,占所分析菌株的72.03%,其次为T家族、CAS家族、Haarlem家族、U家族、LAM家族和MANU2。467株甘肃菌株表现为46种基因型,其中447株属于7个已知家族,20株为新基因型。在所分析的467株甘肃菌株中,主要流行株北京家族菌株有410株,占所分析菌株的87.79%,其次为T家族、Haarlem家族、MANU2、U家族、H37Rv和CAS家族。分析北京家族菌株与患者的性别、年龄、病例类型及治疗史之间的关系,发现两省区北京家族菌株的分布与性别、年龄、病例类型、治疗史无统计学差异(P>0.05)。根据MLVA基因分型结果,778株结核分枝杆菌呈385种基因型,其中505株结核菌可分为112个基因簇(2-72株菌),成簇率为50.51%,其余273株结核分枝杆菌独立成簇,表现为独特的基因型。VNTR-15位点组合分析全部菌株,计算出HGDI为0.987,高于Spoligotyping分型方法的分辨力(HGDI=0.424)。在15个VNTR位点中,9个位点(MIRU26、Mtub21、MIRU10、ETRE、MIRU40、ETRA、MIRU16、Mtub30和MIRU39)对新疆和甘肃地区菌株分型具有良好的分辨力。但是对于同源性较高的北京家族菌株,具有较好分辨力的位点仅有4个(MIRU26、Mtub21、ETRE和MIRU16)本研究全面分析了中国西北部两个省区结核分枝杆菌的基因多态性,确认了当地主要流行菌株为北京家族,但两地的基因型别构成存在明显的差异。在甘肃地区首次发现了CAS家族菌株；同时,在新疆地区发现分离自维吾尔族和哈萨克族病人的22株具有独特分子特征的非北京家族基因型菌株,在与全国其它地区非北京家族菌株的聚类结果中独立自成一群,可能为具有地区特色的新的结核分枝杆菌基因家族。此外,本研究还评价了本实验室标准化的VNTR-15位点组合在新疆和甘肃地区的应用,结果显示15个MLVA位点中只有4个位点具有良好的分辨力,适合应用于两个地区北京家族菌株的基因分型。对不同地区的结核分枝杆菌进行MLVA分型研究时,要充分考虑到各地区间结核分枝杆菌的基因型分布和主要流行株并不相同,因此要依据实际情况调整MLVA位点组合,必要时加入新的位点以增加分辨力。另外,也要考虑寻找新的够用于定义菌株进化地位的多态性标记,将其与传统分型方法联合应用,来提高对菌株的分辨力。
【作者】刘洁；
【导师】万康林；
【作者基本信息】中国疾病预防控制中心，病原生物学，2014，博士
【关键词】结核分枝杆菌；基因多态性；间隔区寡核苷酸分型；多位点数目可变串联重复序列分析；

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