结核分枝杆菌八种蛋白抗原中人T/B细胞抗原表位多态性研究

【摘要】结核病(Tuberculosis,TB)是世界范围内严重威胁人类健康的公共卫生问题之一,据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)估计,2012年全球约有860万的结核病新发病例及130万的结核病死亡病例,其中结核病高负担国家中排前两位的印度和中国的病例数分别占全部病例数的26%和12%。另外,由于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)与人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)共同感染和耐药性(特别是广泛耐药性)结核病的出现,更加重了结核病的危害和治疗难度。为了实现全球结核病的防控目标,近年来,提高结核病的诊断能力以及开发新的、有效的抗结核病疫苗成为结核病研究的热点。并且,随着生物化学、免疫学和分子生物学等学科的研究进步,已经发现有部分结核分枝杆菌抗原,可能在提高结核病的诊断能力或研制新的抗结核疫苗方面具有重要作用。目前,结核病新型疫苗研究的主要方向为重组BCG、亚单位蛋白疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗及改良病毒疫苗等,其中由于重组BCG其具有安全、廉价、易保存、使用方便、可在体内自我繁殖、可刺激机体产生长期的免疫保护等优点,更具发展潜能和研究价值。但是,有研究发现结核分枝杆菌基因组的保守性相对较高,且其中的人T/B细胞抗原表位序列具有更高的保守性,甚至可能在机体免疫识别过程中受益。这给我们研究和开发新的抗结核分枝杆菌疫苗带来挑战,需要对相关现象进行更深入和系统的研究。在本研究中,我们将对8种重要结核分枝杆菌蛋白抗原(MPT64、pstS1、Ag85A/B/C、ESAT6、CFP10和14kDa)的编码基因序列,以及其中的人T/B细胞抗原表位的多态性进行研究,为后续开发新的抗结核疫苗积累数据。首先,我们从来自全国不同省、自治区的结核分枝杆菌临床分离菌株中,选取了包含已在我国发现的全部Spoligotyping类型的菌株180株,以及世界不同国家或地区来源的BCG疫苗株接种株11株,作为本研究的样本菌株,对不同菌株中的8个蛋白抗原编码基因进行PCR扩增和测序,再结合从NCBI网站下载的结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)菌株的全基因组数据,对结核分枝杆菌基因组中的8种蛋白抗原的编码基因的序列多态性进行了研究。其次,依据从免疫表位数据库(ImmuneEpitopeDatabase,IEDB)中获得的结核分枝杆菌基因中的人T/B细胞表位序列,对8个基因中的细胞抗原表位区及非细胞抗原表位区的变异特征进行了研究。分别计算了整个基因编码区、人T/B细胞抗原表位及非细胞抗原表位序列区的dN、dS值和dN/dS值,并据此对不同序列区域可能面临的机体免疫系统选择压力进行了评估。经过对相关基因区的PCR扩增、序列测定和数据比对分析,我们获得了不同基因中的序列多态性数据。首先,有部分突变或变异是多个菌株共有的特征：1)8株结核分枝杆菌临床分离株的MPT64基因中,存在63bp(CDS:196-258)的碱基缺失；2)在所有的牛结核分枝杆菌(Mycobacteriumbovis,M.bovis)和BCG菌株的pstS1基因中,均存在特异性的SNP(T1055C,Val352Ala)变异；3)93株临床分离株的Ag85B基因中均存在一个同义SNP(C714A,Pro238Pro)位点；4)6株临床分离株的Ag85C基因中存在一个异义SNP(G472AG158S)位点。其次,除未在CFP10基因中发现有序列多态性存在以外,其它基因序列中均发现有部分菌株中存在独特的单碱基突变类型,包括单碱基插入和单碱基多态性(SNP),并影响到所在密码子编码的氨基酸。最终,经过计算MPT64、pstS1基因的编码区或其中的人T/B细胞抗原表位区的dN/dS值均>1,且均高于对应基因中的非细胞表位区；而Ag85C基因整个基因编码区,以及其中的T细胞抗原表位区的。dN/dS值>1,其它基因编码区及其中的T/B细胞抗原表位序列区及非细胞中的dN/dS值均<1,且与非细胞抗原表位区的dN/dS值,没有明显的差异。在本研究关注的8种结核分枝杆菌重要蛋白抗原基因中,除CFP10基因外,其它基因中均存在不同程度的序列多态性,依据dN、dS及dN/dS值发现,MPT64、pstS1等基因可能存在正向选择作用,并可能在与机体免疫系统的相互作用中存在免疫逃逸现象；而其它基因则相对保守,显示出纯化选择作用,并有可能作为重组BCG的候选蛋白。
【作者】刘海灿；
【导师】万康林；
【作者基本信息】中国疾病预防控制中心，病原生物学，2014，博士
【关键词】结核分枝杆菌；抗原表位；多态性；

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