HIV-1特定基因突变的耐药性鉴定及其对病毒复制的影响

【摘要】我国艾滋病免费抗病毒治疗开始于2003年，其覆盖率到2011年9月底达到73.5%。随着抗病毒治疗时间的延长，HIV-1感染者中抗病毒治疗失败的情况不断出现，耐药性毒株成为治疗失败的主要原因。我国艾滋病的抗病毒治疗具有鲜明的特点，一是我国流行的HIV-1毒株以CRF01AE、CRF07BC、CRF08BC及B亚型为主，与欧美等国以B亚型为主的情况显著不同；二是使用的抗病毒药物为国产仿制药；三是采取乡镇医疗和疾控机构统一发药及管理病人的治疗模式。这些特点使得我国HIV-1毒株的耐药性具有自己的特点和规律。我国已经开展了HIV-1耐药毒株的流行病学监测，获得了耐药毒株的流行率、影响因素、对抗病毒治疗的影响等一系列重要的数据。在抗病毒治疗发展的过程中，不断有突变被新鉴定为耐药突变，新突变对HIV-1耐药的影响、突变模式、突变之间的相互作用以及新突变对HIV-1毒株的复制能力的影响还没有深入的研究。本课题首先对部分地区HIV-1感染者的基线耐药和HIV-1抗病毒治疗失败后的耐药情况进行了分子流行病学研究。随后对与抗病毒治疗相关的突变及突变组合构建了质粒，转染后利用重组病毒对我国常用抗病毒治疗药物进行了耐药表型检测，并使用合适的方法分析了单一位点的作用和不同位点之间可能存在的相互作用。最后对携带相关突变组合的病毒株的复制能力进行了研究。综合全部研究结果，旨在掌握我国HIV-1耐药毒株流行情况、阐明突变之间的相互作用及携带耐药突变病毒的生物学特征，为临床深入认识HIV-1耐药机理及耐药病人的科学管理提供理论依据、为确保我国抗病毒治疗效果提供实际指导。第一部分我国部分地区HIV-1基因型耐药的横断面研究目前，耐药HIV-1毒株在我国各地广泛出现和流行，掌握耐药毒株流行状况是临床有效治疗病人的基础。本部分研究旨在了解我国HIV-1耐药毒株的分子流行病学特征，为进一步研究和临床抗病毒治疗提供指导。我们收集2009年全国范围内8个省市的304例从未接受抗病毒治疗的艾滋病患者的血浆标本和2010年河南和河北两省476例一线抗病毒治疗失败的艾滋病患者的血浆标本，采用HIV-1基因型耐药检测方法进行了基因型耐药检测，扩增目的基因片段长2.0kb，包含HIV-1蛋白酶的全部99个氨基酸和逆转录酶的全部560个氨基酸，计算耐药毒株流行率并分析耐药相关的因素。结果：（1）2010年河南省和河北省抗病毒治疗失败标本扩增检测成功321份，耐药率高达67.6%，NRTIs和NNRTIs耐药分别达到了54.21%（174/321）和65.42%（210/321）。NRTIs耐药突变主要是TMAs突变和M184V；NNRTIs耐药突变中以K103N和Y181C最为常见，其次是G190A/S和H221Y。Y181C和H221Y联合突变在河北省和河南省的耐药标本中分别占到23.33%（7/30）和16.58%（31/187），K103N/Y181C/H221Y在河北省和河南省耐药标本中分别占6.67%（2/30）和11.76%（22/187）。（2）未接受抗病毒治疗的标本扩增检测成功269份，基线耐药率为7.43%；深圳的基线耐药为17.86%，显著高于其他地区（χ2=4.9327,P=0.0264）；B亚型的基线耐药显著高于非B亚型（P=0.0177）；NNRTIs耐药突变包括K103N、Y181C、V179D/E、G190E和K238N；PIs耐药突变中包括能够引起NFV高度耐药的N88S、D30N和L90M。在这些标本中，新报道的HIV-1流行重组毒株CRF5501B在2009年广州和深圳的男男性行为人群中的流行率为9.84%。结论：受到样本量和标本保存的影响，部分地区的扩增成功率较低，可能对结果有影响。本研究提供了部分地区抗病毒治疗失败耐药和基线耐药的概貌。河南和河北抗病毒治疗失败标本中耐药毒株的流行率非常高，严重地影响后续抗病毒治疗效果。HIV-1基线耐药的流行受到地区和病毒亚型的影响。近年来增长的男男性行为人群中HIV-1的流行亚型更为复杂。跟踪基线耐药病人的抗病毒治疗效果有助于阐明基线耐药对抗病毒治疗的影响。第二部分HIV-1特定基因突变的耐药性鉴定HIV-1的耐药突变十分复杂，截止到2008报道的突变已经达到200多个，且不断有新的耐药相关突变位点被发现和鉴定。在药物选择压力下，一些病毒基因的天然多态性位点很容易转变为耐药相关突变位点。目前，主要耐药突变位点的作用已经清楚，但对很多新出现的和由多态性位点转变为而来的突变的耐药作用及其与主要突变之间的相互作用尚不明确。我国流行的HIV-1毒株亚型显著不同于欧美国家，且我国采用独特的国产仿制药群体性治疗的模式，耐药突变的发生和流行具有鲜明的特点。本研究的目的是阐明在我国接受抗病毒治疗的艾滋病患者中广泛流行的H221Y对耐药的作用及其与其他突变的相互作用。我们从3名临床耐药的艾滋病患者血浆标本中扩增获得含有不同耐药突变组合（K103N/Y181C/H221Y/T215Y、V179E/Y181C/H221Y/T215Y、K101Q/Y181C/H221Y）的3段HIV-1pol区基因，以HIV-1pNL4-3为骨架构建重组病毒。以此为基础，对特定位点进行定点突变或回复突变、转染人胚肾细胞（Humanembryonickidney，HEK293T），收获病毒，构建含有不同突变组合的21株病毒，在MT2细胞上对病毒进行培养扩增，测定感染性滴度（50%tissuecultureinfectiousdose，TCID50），在TZM-bl细胞上测定这些病毒对4种抗HIV药物的敏感性，以pNL4-3病毒上定点突变的3株病毒作为参比。每种药物设11个浓度梯度、2复孔、重复3次，计算50%抑制浓度（50%inhibitionconcentration，IC50），采用析因设计的分析方法计算各个突变对耐药的贡献及突变之间的相互作用。结果：（1）K103N/T215Y显著提高EFV对病毒的IC50（88.98-fold），V179E/T215Y、Y181C和K101Q分别使EFV对病毒的IC50提高18.46-fold、6.12-fold和6.76-fold，H221Y单一突变几乎不影响EFV的IC50值（1.41-fold）。分别使EFV的IC50提高88.98-fold和18.46-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y联合突变均与H221Y无交互作用，而分别使EFV的IC50提高6.12-fold和6.76-fold的Y181C和K101Q均与H221Y有显著交互作用（F=12.49，P=0.0028；F=28.10，P<0.0001）。H221Y可拮抗K101Q对EFV的耐药作用，使其相对于野生型的IC50由提高6.76-fold降低到二者相当。（2）K103N/T215Y和V179E/T215Y均显著提高AZT对病毒的IC50（30.66-fold，13.72-fold）。Y181C显著的降低了AZT对病毒的IC50（0.335-fold）。H221Y对IC50的影响随着基础突变变化较大。分别使AZT的IC50提高30.66-fold和13.72-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y联合突变均与H221Y无交互作用，而分别使AZT的IC50改变0.335-fold和1.50-fold的Y181C和K101Q均与H221Y有显著交互作用（F=18.71，P=0.0051；F=10.53，P=0.0011）。H221Y可拮抗Y181C对AZT的耐药作用，使其相对于野生型的IC50由降低0.335-fold提高到二者相当。（3）K101Q单一位点使3TC对病毒的IC50降低0.48-fold，K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C对3TC的IC50几乎没有影响（1.35-fold、0.80-fold、1.29-fold）。H221Y对IC50的影响随着基础突变变化较大。H221Y可拮抗K101Q对3TC的耐药作用，H221Y与V179E/T215Y有显著的拮抗作用。K101Q、K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C均不会使d4T的IC50显著改变，H221Y单一位点显著提高d4T对病毒的IC50（4.71-fold）。181和221之间不存在交互作用（P=0.9708）。结论：（1）我们首次采用析因分析设计实验方法及分析检验方法发现了221单一位点突变对耐药的贡献及与其他位点的交互作用。（2）H221Y单一位点对d4T的耐药显著提高，对EFV的耐药提高较小，对AZT和3TC的作用随着一起出现的突变位点而不同。（3）Y181C单一位点显著提高AZT的敏感性。（4）基础突变分别对EFV和AZT耐药的影响显著时，H221Y单一位点对耐药的作用及与基础位点之间的交互作用不显著。第三部分携带耐药相关突变的HIV-1毒株的复制能力的研究HIV-1耐药突变可能使病毒的酶活性受损，导致复制能力下降，但病毒也可能发生补偿突变，弥补复制能力的损失。本研究的目的是阐明携带常见耐药突变的HIV-1毒株的复制能力。我们采用平行培养的方法，将第二部分研究中构建的病毒等量接种MT2细胞，在没有药物压力的条件下培养10天，定期取培养上清接种TZM-bl细胞，48小时（hour,h）后测定荧光值，以野生型pNL4-3为参比，绘制病毒的复制动力学曲线，用具有一个重复测量的两因素定量资料的假设检验方法对结果进行分析。结果：（1）pNL4-3179/181/215复制能力在MT2细胞上最强，第三和四天分别提高71.69倍和132.94倍。（2）培养第五天后几乎所有耐药毒株的复制能力都高于野生毒株（2.21倍数-145.69倍）。（3）Y181C和H221Y突变均使pNL4-3179/215的复制能力在第6天和第7天显著的提高（P=0.0066，P<0.0001，P=0.0363，P<0.0001），在pNL4-3103/215病毒携带的突变基础上表现出相反的结果（P<0.0001）。结论：（1）首次发现携带突变V179E/Y181C/T215Y、V179E/H221Y/T215Y、V179E/T215Y、K103N/T215Y、K103N/Y181C/T215Y的复制能力强于野生毒株，可能与他们是NNRTIs耐药突变有关。（2）复制能力的提高也可能是这些毒株耐药的一个因素。（3）应高度警惕高耐药高复制的HIV-1毒株的流行，进行密切监测。
【作者】郭伟；
【导师】李敬云；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，微生物学，2014，博士
【关键词】HIV-1；耐药突变；基因型耐药；表型耐药；复制能力；

【参考文献】
[1]曾建军,肖宜安,孙敏.入侵植物剑叶金鸡菊的繁殖特征及其与入侵性之间的关系[J].植物生态学报,2010,08:966-972.
[2]郭学锐.小学数学课例研究的个案分析[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[3]赵媛媛.面向对外汉语教学的交互动词研究[D].苏州大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[4]刘文煜.户外新媒体广告的互动性研究[D].广东工业大学,设计学,2014,硕士.
[5]倪洪科,杨雪梅,王超,林中.目标安全体系结构及其在银行信息系统中的应用[J].网络安全技术与应用,2003,03:53-56.
[6]吕垚.英汉电影名称翻译[D].鲁东大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[7]张治.电针预处理通过CB1R上调TGF-β1发挥脑保护作用的研究[D].第四军医大学,麻醉学,2014,硕士.
[8]王慧艺.转租法律制度的重构[D].华东政法大学,民商法,2012,硕士.
[9]焉瑾.河南所见东周纽钟的音乐考古学研究[D].中国艺术研究院,音乐学,2014,硕士.
[10]宋御杰.基于混合网格剖分的起伏地表旅行时计算方法研究[D].长安大学,地球探测与信息技术,2014,硕士.
[11]刘建雄.小波和Prony方法在电能质量检测中的应用研究[D].浙江工业大学,2008.
[12]徐有声.国际零售公司采购质量管理系统研究与设计[D].上海交通大学,软件工程,2012,硕士.
[13]朱蕾.废弃革制品皮革性能及资源化利用研究[D].陕西科技大学,环境工程,2013,硕士.
[14]陈伟锋.小区智能家居系统的研究与实现[D].解放军信息工程大学,软件工程,2012,硕士.
[15]张海新,丁伟,刘秀玉,王明星.永新地区近地表校正方法[J].石油地球物理勘探,2008,S2:63-66+177+7.
[16]刘湜.金融业——CRM的“突破口”[J].商业研究,2003,22:115-117.
[17]曹迅.基于多部图的云用户行为认定模型[D].河北大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[18]谭玲.中国电信湖南公司七彩铃音业务精细化营销策略研究[D].湖南大学,工商管理,2012,硕士.
[19]王娜.表皮生长因子受体信号通路与卵巢癌细胞SKOV3/DDP耐药的相关性研究[D].河北医科大学,妇产科学,2013,硕士.
[20]杨冬梅,张庆灵,沙成满.广义系统的H_2最优控制[J].自动化学报,2002,06:920-926.
[21]梁英魁.磁共振扩散张量成像在星形胶质细胞瘤诊断中的应用[D].江西医学院,影像与核医学,2003,硕士.
[22]宫秀军,孙建平,史忠植.主动贝叶斯网络分类器[J].计算机研究与发展,2002,05:574-579.
[23]陈月菊.几种常见食用菌嘌呤含量测定及其加工中动态变化研究[D].南京农业大学,食品科学,2012,硕士.
[24]杨春立.产品知识管理系统研究[D].大连理工大学,2005.
[25]余家国,向全军,马婷婷,李覃.碳/半导体复合光催化材料的制备与光催化性能增强[A].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会.第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会:,2011:1.
[26]贾慧敏.抗除草剂基因转化旱稻的研究[D].河北科技大学,植物学,2013,硕士.
[27]张小彪.基于网络编码的P2P点播算法设计与仿真[D].华中科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[28]张向兰.基于改进PSO的智能机器人路径规划研究[D].西北大学,电路与系统,2014,硕士.
[29]梁晓琴.模拟酸雨对蒙古栎和栓皮栎生理生态特征的影响[D].山东大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[30]孙广玉.自偿性信誉链融资模式下的市场风险分担机制研究[D].青岛大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[31]周庆华.面向电子商务的数据挖掘研究与实现[D].中国人民解放军国防科学技术大学,2002.
[32]李晓刚.巨大芽孢杆菌降低蛋鸡排泄物中氨和硫化氢机理的研究[D].扬州大学,动物营养与饲料科学,2012,硕士.
[33]张微.非耦合、弱耦合正倒向随机微分方程的高阶数值方法及误差估计[D].山东大学,概率论与数理统计,2014,博士.
[34]唐艳梅.基于特征信息的汽车覆盖件点云数据配准技术研究[D].太原科技大学,机械工程,2014,硕士.
[35]蒲铭凯.稠油井管杆防磨技术研究[D].东北石油大学,石油与天然气工程（专业学位）,2013,硕士.
[36]赵学田.基于超材料的RFID天线的设计与研究[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[37]杨迪迪.短孔道有序介孔催化剂的设计及其催化水介质清洁有机反应的研究[D].上海师范大学,2012.
[38]刘瞻.数字出版著作权保护问题研究[D].郑州大学,法律,2013,硕士.
[39]余洪.双源CT容积灌注成像在孤立性肺结节诊断中的应用研究[D].遵义医学院,影像医学与核医学（专业学位）,2013,硕士.
[40]祁晓玲.基于双目视觉的零件多尺寸测量研究[D].兰州理工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[41]杨百元.耗散环境下两量子比特系统的量子纠缠和量子失协动力学[D].湖南师范大学,光学,2014,博士.
[42]姜小红.表面修饰的银纳米材料表面增强拉曼光谱基底用于环境有机污染物检测的研究[D].山东大学,分析化学,2014,博士.
[43]章瑾.因果类“一p就q”复句及其对外汉语教学[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[44]韩涛.侧面人脸识别的研究[D].黑龙江大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[45]贺红英.子宫肿瘤及早期宫颈癌腹腔镜手术近、远期疗效的临床医学研究[D].广西医科大学,肿瘤学,2014,博士.
[46]胡爱平.纳米Fe_3O_4/石墨烯电极材料制备及电化学性能研究[D].湖南大学,2013.
[47]娄跃星.多媒体素材管理与共享系统的设计与实现[D].天津大学,金融信息,2013,硕士.
[48]吴武豪.基于物联网的猪舍环境监控系统研究[D].浙江大学,2014.
[49]李宇.基于IEEE802.11上的无线局域网安全简要分析及改进[D].吉林大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[50]张勇.不同形貌与掺杂的ZnS纳米材料的制备与性能分析[D].扬州大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.