高尔基体糖蛋白GP73在肝脏疾病中的意义及其生物学功能的研究

【摘要】肝癌(hepaticcellcancer,HCC)是临床上死亡率很高的一种肿瘤。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,alphafetoprotein,AFP)是目前临床上唯一用于HCC监测的血清标志物,其灵敏度和特异性均有待提高。近年来研究报道显示高尔基体糖蛋白73(Golgiprotein73,GP73)用于临床诊断肝癌的敏感性和特异性均显著高于AFP,提示我们GP73是最有前景的肝癌诊断的血清标志物。GP73又叫GOLM1(golgimembraneprotein1)或者GOLPH2(golgiphosphoprotein2),它是一种常驻高尔基体的Ⅱ型跨膜糖蛋白。人体正常肝组织的肝细胞表达很少甚至不表达中,但胆管上皮细胞表达强烈。一、临床患者血清中GP73水平的特征分析：本研究收集了2242份血清标本用来完成GP73在临床患者血清中表达的特征分析研究,采用双抗体夹心酶联免疫定量测定方法和免疫组化方法进行GP73的测定,结果发现(1)在正常人群中GP73的水平呈正态分布,GP73的浓度与性别无关,与年龄相关,随着年龄的增长,其表达含量有增加的趋势,其中青年组和老年组差异显著(P<0.001),提示血清中GP73水平与老年组人群肝脏的衰老和损伤可能相关。(2)与健康人群相比,GP73在终末期肝病患者血清中的水平最高,其他肿瘤、病情较轻的肝病以及炎症患者中体内GP73水平虽然出现上调,但幅度低于终末期肝病患者,表现出较明显的肝脏特异性。(3)ROC曲线分析GP73在区分健康人群与肝癌时其诊断准确度能够达到91.9%,即使在慢性乙肝患者人群中检测GP73的诊断准确度也能达到82.7%,显示出良好的诊断价值,明确血清中GP73的检测可以作为肝癌标志物。(4)在拟行器官移植的肝病患者术前血清中GP73的含量显著高于终末期肾病患者,大部分肝、肾器官移植术后患者血清中GP73水平均出现明显的下降,生存曲线分析显示肝移植患者术后GP73升高与患者的生存和肿瘤复发有明显的相关性,提示GP73与疾病进程的关系密切,特别是在AFP阴性的肝癌移植人群,术后监测GP73能够让患者受益。(5)发现肝癌组织GP73呈现出典型的胞浆弥散和包膜浓染的现象,明确肝癌组织和肝硬化组织中GP73表达模式不一致,提示肝癌细胞中GP73表达可能出现了定位改变。(6)慢性乙肝患者中ALT的水平与GP73的水平呈正相关,提示GP73的高表达可能与肝脏损伤有关。以上结果提示我们GP73具有肝癌和肝脏损伤标志物的双重特性,与肝损伤和肿瘤发生密切相关。二、GP73的生物学功能研究：我们的实验结果显示GP73在炎症、肝脏损伤、肿瘤发生时都不同程度高表达,而GP73是人体高尔基体的正常组分,应该在正常的生物活动中行使相应的功能,但目前其在蛋白质分泌、成熟中的作用等生物学功能研究尚不明确。从GP73的分布来看,GP73在人体大部分的组织中表达,其mRNA和蛋白在不同组织中表达水平有明显差异,推测该蛋白质具有管家基因功能,可能具有有效的调控能力以及多种功能。已有报道证实GP73对维持机体的正常生存是不可或缺的,在GP73的C末端截短后小鼠患有严重的肝肾损伤且在18个月的生存率明显降低。另外,有研究小组发现GP73与分泌性丛生蛋白有相互作用、GP73可能以二聚体的形式行使其功能。这些结果提示GP73应该在炎症、肝脏损伤和肿瘤的发生中具有重要功能,通过基础的细胞生物学相关实验,我们的研究发现：1.GP73高表达后影响多种信号传导通路：以乳腺癌和肝癌细胞为模型,通过RNA-seq高通量测序方法,发现(1)GP73高表达在两种细胞系中均引发了大量信号肽基因的高表达,诱导了具有分泌功能,二硫键结合等相关基因的富集；(2)GP73过表达诱导了RASGRP2、STAT2、GTPase以及G蛋白偶连跨膜受体等基因的富集；(3)GP73过表达诱导了大量趋化因子的富集；(4)GP73过表达引起细胞防御信号途径中大量基因的高表达。(5)GP73过表达引起细胞防御信号途径中大量基因的高表达。(6)GP73过表达后,肝癌细胞系中的胆固醇通路被上调15倍以上,是被上调幅度最大的信号通路。以上结果提示我们GP73高表达主要参与了调控细胞防御、细胞生长以及细胞代谢等相关信号通路。2.GP73促进肿瘤细胞生长以及裸鼠成瘤：通过构建GP73稳定转染细胞系和GP73RNAi敲低的稳定细胞系,利用细胞生长实验、瞬时转染方法,细胞同步化实验、裸鼠成瘤实验、流式细胞仪检测技术以及RNA干扰手段发现(1)GP73稳定表达细胞系的生长速度与对照细胞相比明显增快；(2)野生型和GP73糖基化双突变体的过表达均能促进细胞生长；(3)GP73过表达细胞的细胞周期进程明显加快；(4)发现GP73-siRNA组的肿瘤瘤体体积明显小于对照组的瘤体体积。以上结果提示我们GP73可以促进肿瘤细胞生长以及裸鼠成瘤。3.GP73参与炎症发生：利用携带有干扰素启动子的荧光素酶报告基因、NDV-GFP病毒感染细胞为模型,通过免疫印迹方法、免疫荧光方法、荧光显微镜技术和ELISA检测技术发现(1)GP73过表达能够诱导激活先天性免疫应答信号通路；(2)GP73过表达后细胞内pro-caspase-1的总量明显增高；(3)GP73过表达后炎症小体复合物被激活;(4)发现GP73过表达显著抑制病毒的复制：(5)GP73以及GP73糖基化双突变体过表达后,细胞内Fillipin染色明显增强；脂筏在细胞内呈现点状聚集,这种点状聚集与GP73呈现共定位；(7)人血清中GP73的高表达与胆固醇低水平之间具有正相关性。以上结果提示我们GP73很有可能通过炎症信号通路以及代谢信号通路参与调控肿瘤细胞的发生发展。4.GP73与TGF-β信号通路之间关系：通过免疫印迹实验和RNA干扰方法发现(1)较低浓度的TGF-β上调了细胞内GP73的表达,而较高浓度的TGF-β则下调了细胞内GP73的表达；(2)细胞内GP73的水平与Smad3的磷酸化呈现负相关；(3)GP73以及GP73糖基化双突变体过表达后,显著抑制了由TGF-β介导的p21、smad3-p以及E-cadherin的表达上调,促进了由TGF-β介导的vimentin的下调；(4)TGF-β在GP73敲低的细胞系中可以诱导更高水平的p21表达。以上结果提示我们GP73与TGF-β信号通路之间具有反馈关系。总之,本研究通过临床大样本GP73含量的横断面调查,明确了人体血清中GP73的表达受到炎症刺激、肝脏损伤、肿瘤发生的影响,且与移植术后存活率有一定的相关性,特别是在临床患者血清中表现出肝癌和肝脏损伤标志物的双重特性,显示出较高的临床应用价值。在GP73生物学功能研究中,发现GP73与先天性免疫信号通路、炎症小体信号通路以及肿瘤信号通路均有不同程度的作用,GP73过表达可以刺激细胞生长、缩短细胞周期、改变脂阀中的信号转导、影响胆固醇稳态来参与肝癌发生。
【作者】杨晓莉；
【导师】马清钧；钟辉；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，遗传学，2014，博士
【关键词】GP73；RNA-seq；细胞代谢；先天性免疫应答；炎症信号通路；

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