蜱携带病原体多样性及长角血蜱实验传播SFTSV的研究

【摘要】蜱是一种重要的媒介昆虫，广泛寄生于多种脊椎动物，在吸血的过程中能获得和传播病原体。蜱的地理分布广，气候适应性强，同时是多种病原体的传播媒介，包括病毒（如森林脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、发热伴血小板综合征病毒等），细菌（土拉弗朗西斯菌等），立克次氏体（斑点热立克次体、无形体等），螺旋体（伯氏疏螺旋体等），原虫（巴贝西虫等）以及支原体和衣原体等。近年来，我国报导的蜱媒病逐渐增多，严重危害人和动物的健康，引起了人们的广泛关注，研究蜱携带病原体多样性，有助于了解我国蜱传疾病的病原谱，对于了解我国自然疫源地疾病有着深远的意义。我们首先用16SrRNA基因文库的方法对我国新疆维吾尔族自治区的银盾革蜱进行了细菌性病原体的筛查。对452条16SrRNA序列经OnlineRDPClassifier在Confidencevalue80%水平上进行分析，共发现50个物种，分别分布在四门中，最多的一门是变形菌门（Proteobacteria），占62.8%，然后依次是拟杆菌门（Bacteroidetes），占13.5%，厚壁菌门（Firmicutes），占12.4%，放线菌门（Actinobacteria），占11.3%。其中，我们发现了立克次体类微生物，并对其进行了进一步鉴定，结果发现，我们所采集的银盾革蜱中携带两种斑点热立克次体群微生物，分别与Rickettsiaraoultii和R.slovaca最为接近。据报道，R.raoultii和R.slovaca会造成人类导致蜱咬淋巴结病（TIBOLA/DEBONEL，tick-bornelymphadenopathy/Dermacentor-bornenecrosiserythemaandlymphadenopathy），这提示了该地区可能有此病的流行存在。然而，16SrRNA基因文库的方法只能筛查细菌类的病原体。对于不同类型的病原如DNA病毒、RNA病毒以及细胞结构的病原体等，在利用目前的宏基因组学方法和技术进行筛查时，需要根据不同的病原体对样本采用不同的前期处理和测序，这就需要更多的样本和人力物力。为此，我们建立了一种新的基于smallRNA深度测序的全面筛查病原体的方法，并对来自我国北京和上海的长角血蜱携带病原体的多样性展开筛查。这种方法的理论依据是，无脊椎动物的天然抗病毒免疫机制RNA沉默可以产生小片段的病毒源性的siRNA（21-26nt）。另外，又考虑到smallRNA片段可能包含RNA各种生化途径产生的小片段，如rRNAs，tRNAs，snRNA，snoRNA等，因此我们认为用smallRNA深度测序的数据来进行多种微生物病原体的发现是可行的，不仅仅包括病毒，而且也包括原核生物病原体和真核生物病原体。我们利用长角血蜱的smallRNA深度测序数据，对测得的序列进行了生物信息学的分析，预测了斑点热立克次体、柯克斯氏体在蜱中的存在，并且通过实验验证了我们的预测。我们建立的在媒介昆虫中用smallRNA深度测序筛查病原的方法为自然疫源地新发传染病的预警和溯源提供了一条新的行之有效的途径。自2004年我国传染病监测工作加强以来，我国中部地区有不明原因的严重急性发热性疾病零星上报。患者主要临床表现为：流感样症状、血小板减少、白细胞减少；病例呈零星的散在分布，也有少数聚集性病例。该疾病被称为发热伴血小板综合征（Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTS）。2011年，人们发现了一种布尼亚病毒科的新病毒（Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV），其与SFTS的关联与科赫法则相符，被认为是SFTS的病原体。但是SFTS的临床表现并不特异，虽然SFTSV可以认定为能导致SFTS的病原体，但其依然可能与其他传染性病原有关，比如嗜粒细胞无形体、埃里克体等(1)，这些都是可经蜱传的重要病原体。因此，为进一步掌握SFTS高发地区自然疫源地疾病的基本情况，我们结合了16SrRNA文库和smallRNA高通量测序这两种方法的理念，在方法上扬长避短，用更优化的高通量测序方法对河南省信阳地区重要媒介生物长角血蜱展开了病原体的筛查。研究发现，河南省信阳地区的长角血蜱中存在以下病原体：牛无形体（Anaplasmabovis）（9.03%，13/144），中央无形体（A.centrale）（1.39%，2/144），黑龙江立克次体（R.heilongjiangensis）（2.08%，3/144），R.sp.LON-13（0.69%，1/144），R.raoultii（3.47%，5/144），Babesiasp.MA#361-1（0.69%，1/144）以及SFTSV（18.75%，27/144）。其中，我们发现A.bovis和SFTSV的复合感染（2.08%，3/144）。同时，我们对获得的SFTSV全序进行了系统发生分析发现，蜱中的SFTSV与病人的SFTSV聚在一支，这表明了SFTSV、病人和长角血蜱存在着一定的关联，提示了长角血蜱可能是SFTSV传染给人的媒介。日前，人们对于新病毒SFTSV的传播模式尚无明确的结论。有研究证实SFTSV可以通过血液的途径实现人传人的传播，SFTSV病人的体液和排泄物分泌物也扮演者病毒传播的潜在角色。对于SFTSV传播循环，目前的研究尚局限于对流行区的家畜和媒介的流行病学调查。这些流行病学研究表明，长角血蜱很可能是关于SFTSV的传播媒介，但目前还没有足够的证据支持。蜱和宿主在传播循环中的地位不能仅仅依靠现场研究，一些假设还需要实验证据来证实。要明确蜱是不是特定病原体的传播媒介，必须满足以下三个条件：1，蜱从感染的宿主动物中获得特定病原体的能力；2，特定病原体在蜱中经期传播的能力；3，蜱传播特定病原体给宿主动物的能力。因此我们对长角血蜱传播和保持SFTSV的能力进行了实验研究。为明确长角血蜱是否为SFTSV的传播媒介，我们在实验室条件下对长角血蜱传播和保持SFTSV的能力进行了研究。我们用实验室人工培育的无感染SFTSV的长角血蜱种群和从当地病人中分离出的一株SFTSV进行传播实验。我们采用显微注射的方法对蜱进行人工感染，利用PCR和间接免疫荧光试验（IFA）的方法检测蜱对SFTSV的保持能力以及体内SFTSV对敏感动物的感染能力。实验组和对照组分别选用40只雌性成蜱，分别将SFTSV病毒培养上清稀释液和PBS通过肛门注入蜱的中肠，注射后的蜱在人工环境中养殖并传代。在此期间，我们对长角血蜱保持和传播SFTSV的能力进行了评估。实验结果表明，SFTSV进入长角血蜱体内后，由中肠转移到唾液腺。在蜱生长繁殖过程中，病毒也随之增殖，并且传给下一代的卵，在随后的幼蜱期、若蜱期和成蜱期都能检测到病毒的存在。第二代成蜱唾液腺、卵巢和中肠中，能够检测到病毒的存在。血淋巴中检测到了SFTSV的存在，这解释了病毒在长角血蜱组织间转移的现象。唾液中也检测到了病毒的存在，这表明了长角血蜱将病毒传给宿主动物的能力。我们对饲养蜱过程中蜱叮咬的Balb/c鼠做了检测：显微注射的人工感染蜱叮咬的Balb/c鼠SFTSV核酸检测阳性，随后的血清中也检测到了抗SFTSVIgG的存在。通过我们的研究，长角血蜱保持和传播SFTSV的能力得到了证实，SFTSV能够在长角血蜱中经期和经卵传播，SFTSV能够由长角血蜱蜱传播给宿主动物。综上，一方面，我们探索了几种不同的宏基因组学技术广谱高效筛检蜱媒病原体的方法，建立了一种新的基于smallRNA深度测序的全谱病原筛选方法，并验证了本方法的可行性，在长角血蜱体内检测到斑点热立克次体和柯克斯氏体。同时，我们突破16SrDNA文库法和smallRNA深度测序法的局限性，结合这两种方法的思想，扬长避短，又建立了一种基于IonPGM高通量测序平台的方法，对蜱携带的病原体进行全谱筛查，在SFTS流行区河南信阳采集的长角血蜱中检测到无形体、斑点热立克次体、巴贝西虫和SFTSV等病原体。另一方面，对从河南信阳长角血蜱中检测得到的SFTSV进一步进行了基因特征分析与遗传进化分析，证实了当地长角血蜱中的SFTSV与SFTS病人分离的SFTSV的同源性，这提示了长角血蜱可能是将SFTSV传染给人的媒介。在接下来的对长角血蜱携带和传播SFTSV能力的实验研究中，我们证实了SFTSV在长角血蜱中的经期和经卵传播，证实了SFTSV在长角血蜱唾液腺、卵巢和中肠的定植，证实了长角血蜱将SFTSV传播给宿主动物的能力，为长角血蜱是SFTSV传播媒介的观点提供了有力的证据。
【作者】庄璐；
【导师】曹务春；刘玮；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，流行病与卫生统计学，2014，博士
【关键词】蜱；病原体；发热伴血小板综合征病毒；媒介；

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