β-1,4半乳糖基转移酶和PSD-95相关分子在神经损伤修复中的作用

【摘要】一、β-1,4半乳糖基转移酶-I和V在坐骨神经损伤后大鼠腓肠肌中的表达及意义目的：观察β-1,4-半乳糖基转移酶I和V(β1,4galactosyltransferaseI、V,β-1,4-GalT-I、V)在大鼠坐骨神经夹伤和切断后腓肠肌中的表达变化，探讨其在坐骨神经损伤后腓肠肌萎缩和再生过程中可能存在的生物学作用。方法：制备大鼠坐骨神经夹伤和切断模型；测定坐骨神经功能指数；实时荧光定量PCR检测β-1,4-GalT-ImRNA和β-1,4-GalT-VmRNA在坐骨神经夹伤和切断后不同时间腓肠肌中的表达变化；荧光原位杂交技术观察β-1,4-GalT-ImRNA和β-1,4-GalT-VmRNA的定位情况。结果：(1)坐骨神经功能指数检测发现随着夹伤时间的延长，坐骨神经功能指数逐渐升高，至夹伤4w时基本恢复至至正常水平。而坐骨神经切断后坐骨神经功能指数均为-100。(2)在坐骨神经夹伤模型中，实时荧光定量PCR结果显示β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA在正常大鼠腓肠肌中表达量较高。坐骨神经夹伤后6h开始逐渐下降，至伤后2w时达到最低水平，第4w时才恢复至相对正常水平。原位杂交结果表明：在正常情况及坐骨神经夹伤后4w时β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA定位于大量肌细胞及肌卫星细胞中。(3)在坐骨神经切断模型中，实时荧光定量PCR结果显示，β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA在伤后6h开始逐渐下降，至伤后4w仍维持在低水平。原位杂交结果表明：4w时检测到β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA定位于少许肌卫星细胞中。结论：β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA在坐骨神经夹伤和切断后不同时间腓肠肌中的表达水平不同，提示β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA的表达与坐骨神经损伤类型及损伤时间有关，且β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA主要表达于肌卫星细胞中，说明β-1,4-GalT-ImRNA、β-1,4-GalT-VmRNA在坐骨神经损伤后腓肠肌再生过程中发挥重要的作用。二、β-1,4-糖苷键在坐骨神经损伤后大鼠腓肠肌中的表达及意义目的：观察β-1,4-糖苷键（Galβ1,4-N-acetylglucosamine,Galβ-1,4-GlcNAc)在大鼠坐骨神经夹伤和切断后腓肠肌中的表达情况，探讨其在坐骨神经损伤后腓肠肌萎缩和再生过程中可能存在的生物学作用。方法：制备大鼠坐骨神经夹伤和切断模型；采用凝集素印迹分析（Lectinblot）和RCA免疫荧光染色(RCAimmunofluorescentstaining，RCA-I)技术观察Galβ-1,4-GlcNAc在正常及坐骨神经损伤后大鼠腓肠肌中的表达变化及定位情况。结果：(1)凝集素印迹分析表明Galβ-1,4-GlcNAc的表达在坐骨神经夹伤后6h开始逐渐下降，至伤后2w时达到最低水平，第4w时恢复至相对正常水平。与β-1,4-GalT-I和VmRNA的表达趋势相一致。(2)利用特异性结合Galβ-1,4-GlcNAc的RCA-I研究证实：在正常情况及坐骨神经夹伤后4w时Galβ-1,4-GlcNAc定位于大量肌细胞及肌卫星细胞中，而在坐骨神经夹伤后2w以及坐骨神经切断后2w和4w时可检测到Galβ-1,4-GlcNAc定位于少许肌卫星细胞中。结论：Galβ-1,4-GlcNAc在坐骨神经夹伤和切断后不同时间腓肠肌中的表达水平不同，提示Galβ-1,4-GlcNAc表达与坐骨神经损伤类型及损伤时间有关，且Galβ-1,4-GlcNAc主要表达于肌卫星细胞中，说明Galβ-1,4-GlcNAc在坐骨神经损伤后腓肠肌再生过程中发挥着重要的作用。三、Kv4.2与PSD-95在慢性坐骨神经损伤后大鼠脊髓及坐骨神经的表达及意义目的：探讨电压门控型钾通道4.2(Voltagegatedpotassiumchannel4.2,Kv4.2)与突触后致密区蛋白95（Post-synapticdensityprotein-95,PSD-95）在慢性坐骨神经损伤后大鼠脊髓及坐骨神经的表达变化及在脊髓中的共定位情况，观察是否参与了疼痛传导过程。方法：制备大鼠慢性坐骨神经压迫性损伤模型（Chronicconstrictioninjury,CCI），通过逆转录聚合酶链反应（Reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)及免疫印迹（WesternBlotting）等方法分别测定Kv4.2与PSD-95在坐骨神经及脊髓中的mRNA和蛋白水平的表达变化，采用免疫荧光双标技术探讨Kv4.2和PSD-95与胶质细胞及神经元在脊髓中的共定位情况。结果：(1)Kv4.2mRNA在正常坐骨神经组织中度表达，坐骨神经损伤后1d到5d下降，随后升高，7d达到峰值；蛋白水平未检测出。(2)Kv4.2mRNA在正常脊髓中高度表达，坐骨神经损伤后1d到5d下降，7d后增高，但总体水平较正常水平低；蛋白水平在正常脊髓中度表达，在损伤后3d降到最低点，5d开始缓慢上调，持续到14d仍显著增加。(3)PSD-95mRNA在正常坐骨神经中度表达，损伤后5d显著上调持续到10d，14d有下降趋势，但仍比正常水平高；蛋白水平在损伤后1d到3d时明显降低，而在损伤后5d时明显增加，一直持续到14d。(4)PSD-95mRNA在正常脊髓中高度表达，坐骨神经损伤后缓慢下降，损伤后7d开始上调，10d达到高点；蛋白水平在损伤后显著下调，10d后开始上调，并且变化趋势基本与Kv4.2相似。(5)在腰脊髓切片中，荧光免疫双标发现Kv4.2与PSD-95共定位于神经元，并且在损伤后集中在脊髓背侧角区域，与疼痛相关，而与星型胶质细胞无共定位。结论：Kv4.2、PSD-95在慢性坐骨神经损伤后不同时间坐骨神经及脊髓中的表达水平不同，提示Kv4.2、PSD-95的表达与坐骨神经损伤时间有关，且Kv4.2与PSD-95共定位于神经元，并且在损伤后集中在脊髓背侧角区域，与疼痛相关，而与星型胶质细胞无共定位，说明慢性坐骨神经损伤后，坐骨神经本身及其上游脊髓中的Kv4.2及PSD-95表达水平明显改变，二者共同参与了慢性疼痛过程，并且与感受伤害性刺激神经元兴奋性有关。
【作者】赵建美；
【导师】汪健；
【作者基本信息】苏州大学，儿科学（专业学位），2013，博士
【关键词】β-1,4半乳糖基转移酶-I和V；坐骨神经损伤；实时荧光定量PCR；原位杂交；β-1,4-糖苷键；凝集素印迹分析；RCA免疫荧光染色；慢性周围神经损伤；电压门控型钾通道4.2；突触后致密区蛋白95；逆转录聚合酶链反应；免疫印迹法；免疫荧光双标；

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