中华蜜蜂谷胱甘肽S-转移酶和小分子热激蛋白基因的生物学功能分析

【摘要】自然生态环境的变化使得蜜蜂种群面临日益严峻的生存和延续考验。提高蜜蜂自身防御能力是保持蜂群健康发展的重要前提。中华蜜蜂(Apisceranacerana)是我国特有的蜜蜂种质资源,对于维护与其有关的植物共生生态系统的平衡,具有重要的经济价值和社会效益。本研究基于已经证实的谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases,GSTs)参与调控生物体的抗氧化功能和小分子热激蛋白(smallheatshockproteins,sHSPs)在细胞损伤防御及生物保护中执行的特殊作用,以中华蜜蜂为实验材料,开展了GSTO2和sHsp22.6基因的功能研究,从分子水平上探讨了中华蜜蜂自身防御能力与其GSTO2和sHsp22.6基因的联系。具体研究结果与主要结论如下：(1)中华蜜蜂GSTO2基因的分子特性和功能分析根据西方蜜蜂(ApismelliferaLinnaeus)的同源序列,利用RT-PCR和RACE-PCR的方法,从中华蜜蜂中克隆到一个新的Omega族GST基因,命名为AccGSTO2。序列分析表明：该基因cDNA全长为1365bp,包括321bp的5’非翻译区、324bp的3’非翻译区和720bp的开放阅读框,编码一个包含239个氨基酸残基的多肽,预测分子量和等电点分别为27.785kDa和6.21。中华蜜蜂AccGSTO2的氨基酸序列与其他昆虫GSTOs有较高的同源性,并具有细胞质GST超家族保守的功能区域。用TFSEARCH在线软件程序对分离的AccGSTO2基因启动子区域进行了分析,不仅预测到CF2-Ⅱ、BR-C、NIT2等若干与早期组织发育和生长相关的转录因子结合位点,两个与调节环境应激有关的转录因子(HSF和AP-1)以及基因表达调控元件(CREB和C/EBP)的结合位点也被发现。这些结果表明,AccGSTO2基因可能参与蜜蜂的发育和环境应激响应。采用qRT-PCR和Westernblot的方法研究了中华蜜蜂不同发育时期和组织中的AccGSTO2基因的表达特性。结果表明,在3日龄幼虫时期和脑组织中AccGSTO2表达量最高,表明AccGSTO2可能与幼虫早期发育及维持蜜蜂脑组织的正常功能相关。应用qRT-PCR的方法探究了AccGSTO2基因在不同生物及非生物应激中的表达特性。结果表明,AccGSTO2基因的转录水平受到蜂球囊菌、黄曲霉菌、20羟基蜕皮激素(20E)等生物因素及温度、紫外线、H202、农药、CdCl2等非生物因素的应激而诱导提高,但HgCl2处理后则出现基因转录的抑制现象。Westernblot结果在蛋白水平上进一步证实了CdCl2和黄曲霉菌等处理对基因表达的诱导作用,蜜蜂体内氧化状态的测定表明这种诱导是氧化应激的结果。综上结果表明,AccGST02基因可能在中华蜜蜂的氧化应激和组织发育中发挥重要作用。利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)的方法进一步研究了AccGST02基因的生物学功能。将合成的dsAccGST02注射到新出房的成年蜜蜂胸部或饲喂3日龄幼虫,qRT-PCR结果显示,成年蜜蜂注射后第3天和幼虫饲喂1天后,AccGST02的表达量降低最为显著。免疫组织化学的结果也发现成年蜜蜂的头部、肌肉和中肠,幼虫的中肠、马氏管和脂肪体细胞的表达量相比对照组明显减少。上述处理组蜜蜂的抗氧化基因,除Accp450的转录增强外,AccGSTD,AccGSTs4,AccSOD,AccCAT的转录水平都出现不同程度的降低。与对照组蜜蜂相比,dsAccGST02处理组蜜蜂的H202,丙二醛(MDA)含量明显升高,存活率显著降低。以上结果一方面表明了dsAccGST02处理成功抑制了蜜蜂AccGSTO2基因的表达,同时也表明AccGST02基因的敲除破坏了蜜蜂抗氧化体系的平衡,降低了蜜蜂的生存率。采用原核表达载体pET-30a(+)并优化诱导表达条件成功获得了可溶性的AccGST02重组蛋白,进一步通过亲和层析的方法进行分离纯化,纯化的重组蛋白的浓度达到1.89mg/mLo酶学特性的分析表明,重组AccGSTO2不仅具有对通用底物CDNB的谷胱甘肽(GSH)结合活性和以异丙苯-过氧化氢、叔丁基过氧化氢为底物的GSH过氧化物酶活性,还有较高的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性。重组AccGSTO2的最适温度是25℃、最适pH为7.0。利用混合功能氧化(mixed-functionoxidation,MFO)系统和纸盘扩散分析的方法研究了重组AccGSTO2蛋白的抗氧化功能。在MFO实验中,重组AccGSTO2蛋白以浓度依赖的方式保护质粒DNA免遭系统中产生的羟自由基的剪切,并且发现这种保护作用与分子中半胱氨酸的巯基有关。纸盘扩散试验的结果为重组AccGSTO2蛋白在氧化条件下的保护作用提供了进一步的证据。通过定点突变的方法获得了3个AccGSTO2的突变体：C28A、C124A和C217A。酶动力学和内外荧光光谱学研究的结果发现,突变体C28A和C124A有明显的酶活性丧失和最大发射波长的偏移。MFO系统和纸盘扩散分析的结果为这两个位点半胱氨酸在AccGSTO2抗氧化功能方面的关键作用提供了一个直接证据。3个突变体的三维同源结构模型也提供了一个直观的证据,突变体的表面电荷分布、疏水性斑块及空间结构的改变可能是引起其部分功能丧失的重要因素。突变体C217A则与野生型AccGSTO2的功能特性基本相似。以上结果表明Cys28和Cys124在维持AccGSTO2的结构和功能方面发挥重要作用。(2)中华蜜蜂sHsp22.6基因的分子特性和功能分析利用上述的方法,从中华蜜蜂中克隆到一个新的小分子热激蛋白基因,命名为AccsHsp22.6。该基因cDNA全长904bp,其中5’非翻译区115bp、3’非翻译区204bp和开放阅读框720bp,编码一个包含194个氨基酸残基的多肽,预测分子量22.605kDa,等电点5.88。中华蜜蜂sHSP22.6的氨基酸序列与其他昆虫sHSPs有较高的同源性,并具有sHSP超家族典型的结构特征。通过MatInspector在线软件程序,在分离的AccsHsp22.6基因启动子区域预测到参与早期组织发育的转录因子结合位点(CF2-Ⅱ、BR-C、CdxA和NIT2)。几个与环境应激及免疫响应有关的转录因子结合位点(HSF、AP-1、Nrf2、NFκB口p53等)也被发现。以上结果表明,AccsHsp22.6基因可能参与蜜蜂的早期发育和应激保护机制。利用qRT-PCR和Westernblot的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同发育时期和组织中的表达特性。结果发现,该基因总是在蜜蜂不同发育时期的转型期高水平表达,尤其在新出房的成虫和中肠组织中表达量最高,表明AccsHsp22.6可能参与蜜蜂发育时期的转换及维持中肠组织的正常功能。应用qRT-PCR的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同实验条件下的表达特性。结果表明,AccsHsp22.6基因的转录水平在大多数处理中诱导上调,包括热、冷、紫外线、H202、三氟氯氰菊酯、CdCl2等非生物因素和蜂球囊菌、黄曲霉菌、20羟基蜕皮激素(20E)等生物因素。但是该基因在25℃、辛硫磷、百草枯、HgCl2处理后其转录没有明显的诱导,有时甚至出现抑制的现象。以上结果表明,AccsHsp22.6基因可能在中华蜜蜂应对大多数不利因素的应激保护中发挥重要作用。利用RNAi的方法进一步研究了AccsHsp22.6基因的生物学功能。将合成的dsAccsHsp22.6注射到新出房的成年蜜蜂胸部,qRT-PCR结果显示,成年蜜蜂注射后第1-3天,AccsHsp22.6的表达量降低较为显著。免疫组织化学的结果也发现,成年蜜蜂的中肠、马氏管、肌肉和脂肪体细胞的表达量均比对照组明显减少。在4℃和50℃条件下,dsAccsHsp22.6注射3天后的蜜蜂其存活率与对照组蜜蜂相比显著降低。以上结果不仅说明AccsHsp22.6基因的表达被有效抑制,而且表明该基因的敲除降低了蜜蜂对极端温度的耐受能力。采用原核表达载体pET-30a(+),优化诱导表达条件,通过亲和层析的方法成功表达并纯化了可溶性的AccsHSP22.6重组蛋白,纯化蛋白的浓度达到1.67mg/mL。体外分子伴侣活性的分析表明,AccsHSP22.6纯化蛋白能有效保护苹果酸脱氢酶免遭热变性。过表达AccsHsp22.6的重组细菌在4℃和50℃条件下有更高的存活率,表明AccsHsp22.6的表达增强了大肠杆菌的温度耐受性。纸盘扩散分析的实验也提供了重组AccsHSP22.6蛋白具有抗氧化功能的直接证据。
【作者】张媛英；
【导师】郭兴启；
【作者基本信息】山东农业大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】中华蜜蜂；GSTs；sHsps；基因；功能分析；

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