轴突导向分子Sema4D参与心肌梗死的基础与临床研究

【摘要】目的：心肌梗死是冠状动脉粥样硬化血栓性疾病导致病人死亡的严重临床急性事件之一，其早期诊断、监控和治疗仍是目前广大临床和基础研究工作者的一项艰巨任务。本研究平台曾报道了Sema4D参与动脉粥样硬化血小板活化和血栓形成过程，提示Sema4D可能也参与心肌梗死的病理生理过程。因此，本研究利用体内和体外的实验方法，对Sema4D在心肌梗死过程中的基础与临床机制进行了较全面深入的研究，从而为心肌梗死的发病机制提供理论依据及临床早期诊断指标。方法：本文首先纯化了Sema4D细胞外片段重组蛋白，利用Sema4D细胞外段单克隆抗体（#3，#4），建立了人血浆可溶性Sema4D水平的夹心ELISA检测方法，并检测了临床心肌梗死病人外周血可溶性Sema4D水平。为了研究Sema4D参与心肌梗死的机制，本文建立了改良的小鼠心肌缺血再灌注动物模型。为了观察心肌梗死后心功能的变化，分别在两组小鼠接受心肌缺血再灌注术前和术后28天进行心脏超声检测，从而确定Sema4D基因敲除对心功能的影响。在小鼠心肌缺血再灌注模型的基础上，应用免疫组化的方法检测了两组小鼠心脏内部在缺血45分钟和分别给予再灌注2分钟，15分钟，30分钟及60分钟后的微血管血栓形成情况。为了检测血液系统Sema4D对心肌缺血再灌注的影响，在上述处理条件下，对另外两组小鼠分别进行心脏穿刺抽血并应用流式细胞仪检测两组小鼠心肌缺血再灌注后其血小板与白细胞间的相互作用情况及血小板Syk磷酸化情况。本文进一步应用Real-TimePCR方法明确Sema4D及其受体基因在小鼠心脏的表达情况，以探讨Sema4D下游信号通路机制。此外，我们对心肌缺血再灌注过程中的两项重要指标，即ROS生成和钙离子含量进行检测。结果：1.夹心ELISA方法检测正常人群与心肌梗塞病人血浆样本后发现，心肌梗塞病人血浆中可溶性Sema4D的含量明显增高(10.980±6.150ng/ml，n=87vs.5.183±3.301ng/ml，n=53，P<0.0001)，提示Sema4D参与心肌梗死的病理生理过程。2.为了研究Sema4D参与心肌梗死的机制，我们成功建立了改良的小鼠心肌缺血再灌注动物模型。3.两组小鼠心肌缺血再灌注手术后心脏梗死的面积评估显示，Sema4D基因敲除后可显著降低小鼠心肌缺血再灌注后的梗死面积10.7%，n=7vs.30.2%，n=9，P<0.01）。4.手术前及术后28天的超声心动检查结果显示Sema4D基因敲除可改善心肌缺血再灌注所带来的心脏功能改变。Sema4D-/-小鼠术后左心室收缩末期直径（LVID,s，P<0.05）及左心室舒张末期直径（LVID,d，P<0.05）均小于对照组；射血分数（LVEF）高于对照组（P<0.05）；左室短轴缩短率（LVFS%）对照组（P<0.05）。5.免疫组化切片结果显示Sema4D基因敲除可有效抑制小鼠心肌缺血再灌注后心脏微血管血栓形成并改善血管内血栓的堵塞情况。6.流式结果显示Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后血小板与白细胞间的相互作用，结果有统计学意义（P<0.01）。7.Real-TimePCR方法检测发现，Sema4D及其受体基因在小鼠心脏均有表达，为随后的Sema4D下游信号通路机制研究提供了可靠依据。8.两组小鼠心脏匀浆后进行试剂盒检测发现，Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后心肌的ROS生成（P<0.01）。9.两组小鼠心脏匀浆后进行试剂盒检测发现，Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后心肌的Ca2+含量（P<0.05）。结论：本研究发现，Sema4D参与心肌梗死的病理生理过程。其机制可能为：1）Sema4D通过心肌非依赖途径参与心肌缺血再灌注，具体表现为Sema4D基因敲除后小鼠心肌血栓形成减少，Syk磷酸化降低，血小板与白细胞间的相互作用减少；2）Sema4D可能通过心肌信号通路途径参与心肌缺血再灌注，因本文已发现Sema4D及其受体在小鼠心肌有表达，为其下游信号分子机制的研究提供了理论依据。
【作者】刘晓辉；
【导师】朱力；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2013，博士
【关键词】Sema4D；血小板；血栓形成；心肌缺血再灌注；

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