小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组及肌球蛋白轻链基因家族结构特征分析

【摘要】绵羊是羊肉的重要来源，随着羊肉价格的逐渐盘升，如何提高羊只的产肉量、改善羊肉品质成为亟待解决的问题。研究不同生长性能绵羊骨骼肌间的全转录组和差异表达将有助于揭示肌肉生长和发育的分子机制。近年来，基于第二代高通量测序平台的转录组测序（RNA-Seq）可以实现快速、全面地获得特定组织于某个状态下几乎所有的转录本。本试验以生长性能显著不同的两只小尾寒羊和杜泊羊的臂二头肌为试验材料，分别构建了它们的转录组文库，并采用IlluminaHiSeq2000高通量测序平台进行测序；获得的测序序列与绵羊参考基因组和参考基因比对后全面揭示两个转录组文库的特征，包括基因表达、基因注释、差异基因、可变剪接、新转录本、cSNP和SSR等；以qRT-PCR法对从中随机选取的12基因进行了相对定量分析对高通量测序数据的可靠性进行验证；采用RACE等方法克隆了小尾寒羊和杜泊羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因的全长cDNA序列，利用GENSCAN等生物软件对cDNA序列以及编码蛋白的结构特征等方面加以分析，并对这几个基因在绵羊的不同组织间mRNA表达谱进行分析。主要研究结果如下：（1）经RNA-Seq分析，分别在小尾寒羊和杜泊羊的两个转录组文库中得到50264608和52794216条长为90bp高质量的测序序列。这些序列中各有约三分之二以上的序列可以比对到绵羊的参考基因组中，而有42.77%和33.10%的序列被可被比对到绵羊的20236个参考基因上。在绵羊臂二头肌中，只有约1%的参考基因属于高表达基因（RPKM≥1000），而93%以上的基因为低表达基因（RPKM≤1000）。（2）两个转录组文库间发现有1300个差异表达基因（FDR≤0.001且│log2Ratio│≥1），其中有554个基因在小尾寒羊中表达上调而746个表达下调。对它们进行GO功能注释时发现分别有1066、1137和1067个基因可被注释到GO的生物学过程、细胞组分和分子功能条目中。而1152个差异表达基因被注释到了KEGG数据库的240条通路中，其中以新陈代谢通路（含有114个基因）和肌动蛋白细胞骨架通路（21个基因）包含基因最多。综合两方面的注释结果共发现有31个差异表达基因与肌细胞发育、分化和骨骼肌的生长相关。蛋白互作网络分析发现差异表达基因中的细胞外基质结构组分——整合蛋白ITGA8和胶原蛋白COL4A1与其他蛋白间互作最多，而肌球蛋白（myosin）、肌钙蛋白（troponin）以及一些与生长和发育密切相关的调节因子（IGFBP5、TGFBR3和VEGF）与其他基因的互作较少。（3）在小尾寒羊和杜泊羊文库中分别存在着40481和38851个潜在的cSNPs以及4721个SSRs，并分别以A→G和（AC）n为主要的分子标记。其中cSNPs主要分布于绵羊的1、2和3号染色体上。（4）小尾寒羊和杜泊羊文库中分别有37.72%和39.03%表达的基因发生了可变剪接，并以A3SS为主要的剪接方式。依照测序序列对6989个参考基因的两端或一端进行了延伸和优化。共发现了123678个平均长为343bp的新转录本单元。（5）克隆得到了绵羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因的全长cDNA序列。其中MYL1基因包括长度不同的两条cDNA序列，二者在5′端有所不同而3′端的序列相同。将这些序列提交至GenBank，登录号分别为KJ700419、KJ710701、KJ710702、KJ710703、KJ710704、KJ710705、KJ710706、KJ710707和KJ768855。同一个基因的cDNA序列在两个品种间的同源性均高于与NCBI中预测序列的同源性，主要表现为5′端和3′端长度和序列的不同。（6）绵羊MYL1、MYL2、MYL3和MYL4基因均包括5个外显子，它们的起始密码子上游5′侧翼序列中含有大量肌细胞增加因子MEF2以及生肌调节因子MyoD和MyoG的结合位点。（7）绵羊MYL1a、MYL1b、MYL2、MYL3和MYL4蛋白中只有1~2个氨基酸与NCBI中的预测序列不同。序列分析结果表明它们均为偏酸性蛋白、亲水性较好、无信号肽、有多个糖基化和磷酸化位点；二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主；三级结构以人肌球蛋白轻链Ⅱ为最佳模板，两端呈对称性桶状；聚类结果显示脊椎动物中绵羊与山羊、人与大熊猫、灰鼠猴子与猕猴、小鼠与褐家鼠、牛和牦牛、猫与狗相近，而斑马鱼和爪蟾与以上脊椎动物相距最远。（8）绵羊MYL1基因主要在背最长肌中表达，两种可变剪接体MYL1a在杜泊羊中表达量高于小尾寒羊，而MYL1b在小尾寒羊中表达量高于杜泊羊；MYL2、MYL3和MYL4基因主要在心肌中表达；MYL4基因在杜泊羊背最长肌中表达而在小尾寒羊背最长肌中不表达；MYL1基因及其不同的可变剪接和MYL4基因与绵羊骨骼肌的生长有关。综上所述，本试验获得的对小尾寒羊和杜泊羊臂二头肌转录组的高通量测序分析，为进一步筛选肌肉生长和发育相关的基因提供数据。同时，对绵羊肌球蛋白轻链基因家族cDNA序列的克隆和特征分析为后期基因功能和调控机制的研究奠定了基础。
【作者】张春兰；
【导师】王建民；
【作者基本信息】山东农业大学，动物遗传育种与繁殖，2014，博士
【关键词】绵羊；高通量测序；臂二头肌；转录组；肌球蛋白轻链基因；

【参考文献】
[1]邵敏娇.支付方式、消费动机对消费额度的影响[D].苏州大学,应用心理学（专业学位）,2014,硕士.
[2]刘智宇.K域的亚域介导芥菜开花负调因子SVP与FLC同源和异源蛋白互作[D].西南大学,蔬菜学,2014,硕士.
[3]蔡峥嵘.深圳新世纪饮水科技有限公司整合营销研究[D].湖南大学,工商管理,2003,硕士.
[4]殷亮.京港合资合作探析[D].首都经济贸易大学,产业经济学,2004,硕士.
[5]回广睿.我国科技金融的效率评价及其影响因素分析[D].西北大学,金融学,2014,硕士.
[6]王爱国.BOIC核心人力资源管理研究[D].天津大学,工商管理,2004,硕士.
[7]李俊生.基于通风方式对高温隧道掌子面温降效果的研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[8]段凤阳.清热止血方、GTW通过干预肾小球系膜细胞、足细胞轴中TNF-α、nephrin治疗HSPN蛋白尿的体外研究[D].河南中医学院,中医儿科学,2013,硕士.
[9]徐晓燕.我国乳制品主要追溯系统的编码及应用[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[10]裴月峰.新入职律师工作压力、心理健康及其关系研究[D].河北师范大学,心理健康教育,2014,硕士.
[11]朱海峰.面向主题的知识获取与知识管理研究[D].机械科学研究院,2003.
[12]高宇.转录因子E2F1在肾透明细胞癌中的表达和意义[D].中国人民解放军医学院,外科学,2013,硕士.
[13]吕妍.氮磷添加对浙江天童木荷林土壤呼吸及凋落物特性的影响[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[14]王喆.益气活血通脉方加减联合西药治疗糖尿病周围神经病变的临床研究[D].北京中医药大学,中医学,2013,硕士.
[15]唐磊华.MDCT靶扫描技术在胃癌诊断中应用初探[D].苏州大学,影像医学与核医学,2013,硕士.
[16]蒋润芳.我国案例指导制度研究[D].兰州大学,法理学（专业学位）,2013,硕士.
[17]朱润晔,张良,毛玉波,姜理英.介质阻挡放电反应器降解邻二甲苯的特性研究[J].浙江工业大学学报,2014,06:650-654.
[18]孙亚梅.射阳县乡村旅游可持续发展研究[D].南京农业大学,农业推广,2011,硕士.
[19]蒋建华,刘程军,刘刚,王一铭.我国区域信息产业的空间格局及其演化研究[J].中国科技论坛,2014,02:92-97.
[20]夏云彦.中型高压三相感应电动机起动过程研究及性能计算[D].哈尔滨理工大学,电机与电器,2012,硕士.
[21]邱彩珍.新疆阿尔泰伟晶岩锂辉石矿物学特征研究[D].中国地质大学（北京）,宝石学,2014,硕士.
[22]田高良,韩洁,李留闯.连锁董事与并购绩效——来自中国A股上市公司的经验证据[J].南开管理评论,2013,06:112-122.
[23]罗进权.影子银行体系及监管研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2014,硕士.
[24]成李娜.LTE-A系统中异构网的小区搜索和下行同步过程的研究[D].北京邮电大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[25]陈虹桥.A企业危化品运输风险管理研究[D].北京交通大学,2013.
[26]王柏斌.信息内容对微博营销效果影响的实证研究[D].江苏科技大学,工业工程（专业学位）,2014,硕士.
[27]谢玄.公共危机管理中政府与媒体互动关系研究[D].西北大学,行政管理,2014,硕士.
[28]张庆文,任初农.微处理机控制铣床刀具补偿进给[J].自动化学报,1984,04:298-303.
[29]庄军,袁梅,刘侃,杨正国.基于HIS下的决策支持系统的开发设想[J].医学信息,2005,03:177-181.
[30]王明,徐颖华,丁旭芬,马淳安.准毛细间隙反应器中直接电氧化合成茴香醛二甲基缩醛[J].化工学报,2014,06:2193-2201.
[31]程慧娟.鼻型结外NK/T细胞淋巴瘤中NF-κBp65、HIF-1α、MMP-9的表达及其与血管生成的关系[D].郑州大学,耳鼻咽喉头颈外科,2013,硕士.
[32]黄杰勋,莫建民,李非里,盛光遥.生物降解对黑碳及土壤上苯酚脱附行为的影响[J].生态学报,2013,12:3639-3647.
[33]陈凯.粤超联赛品牌建设的理论与实证研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[34]沈旭昌.隐私保护的分布式数据挖掘系统[D].浙江工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[35]李珍.武安落子调查与研究[D].山西师范大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[36]郭永生.数据仓库增量维护技术的研究[D].东南大学,2004.
[37]王薇.《现代汉语词典》（第6版）“A……B……”四字组合框式结构研究[D].河北师范大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[38]赵珍.中小企业创新网络构建及其创新绩效评价研究[D].浙江工业大学,2004.
[39]张婷婷.企业家道德关怀研究[D].南京财经大学,思想政治教育,2013,硕士.
[40]冯洁.国家公派留学回国政策的改进[D].南京师范大学,高等教育学,2012,硕士.
[41]张琼,张宪敏.价值工程在城市测绘中的应用[J].黑龙江测绘.1994(Z2)
[42]杨蕾.有关味觉词汇语义扩张的日汉对比研究[D].苏州大学,日语语言文学,2013,硕士.
[43]杜允.石家庄永昌足球俱乐部新闻发布会口译实践报告[D].河北师范大学,翻译,2014,硕士.
[44]胡璇.养殖半滑舌鳎腹水病病原分离、鉴定及组织病理学研究[D].天津农学院,水产养殖,2014,硕士.
[45]包煊,陈建华,郭昕,汪志华.电子剪报系统—EPCutter的设计和实现[J].计算机工程,2002,10:238-240+247.
[46]李振兴,尹项根,张哲,王育学,唐金锐.广域继电保护故障区域的自适应识别方法[J].电力系统自动化,2011,16:15-20.
[47].《中国电机工程学报》2014年度主要审稿单位(按审稿数量排序)[J].中国电机工程学报,2014,36:6625-6626.
[48]罗雯.上市公司法商管理指数研究[D].中国政法大学,企业管理,2013,硕士.
[49]彭星光,张帅,刘坤.从动态适值空间补偿信息:一种抗病态合作协同进化算法[J].控制与决策,2015,01:25-31.
[50]叶凤仙.我国文化贸易竞争力及影响因素分析[D].安徽大学,国际贸易学,2013,硕士.